一种几丁质酶突变体制造技术

本发明专利技术涉及酶工程技术领域，具体的说是一种几丁质酶突变体

【技术实现步骤摘要】
一种几丁质酶突变体ChiM
‑
BL及其应用


[0001]本专利技术涉及一种几丁质酶突变体
ChiM
‑
BL
及其应用，属于酶工程

。

技术介绍

[0002]几丁质寡糖是几丁质水解产物，相比于几丁质其具有良好的水溶性，因此展现出更多的生物活性，在农业种植
、
食品以及医药等领域具有广泛的应用价值
。
目前几丁质寡糖的制备方式以化学法为主，通过强酸进行溶解从而制备不同类型产品
。
化学法由于加工过程中应用大量强酸
(
如浓盐酸
、
硫酸
、
磷酸
)
，从而带来一系列问题如环境污染
、
产物结构不完整等
。
因此急需开发绿色
、
环保
、
可持续的加工方法，随着国内外对于几丁质寡糖制备研究的深入，发现酶法能够很好的规避化学法的缺陷，酶法能够特异性制备不同聚合度和活性的几丁质寡糖
。
几丁质酶在酶法制备几丁质寡糖工艺中扮演重要角色，其能够定向切割几丁质内部糖苷键，从而形成不同分子量几丁质寡糖
。
目前限制酶法工艺推广的主要因素是几丁质酶生产成本高，催化效率低，因此需要研发高效几丁质酶
。
在我们前期研究中通过突变和筛选获得几丁质酶
ChiM(
专利申请号
CN202110762467.X)
，几丁质酶r/>ChiM
能够分解胶体几丁质生成几丁质寡糖，但是其水解效率仍有不足，需要进一步提升
。
[0003]有鉴于此特提出本专利技术
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的就在于为了解决上述问题而提供一种几丁质酶突变体
ChiM
‑
BL
及其应用，提高了水解效率，为其产业化应用奠定基础
[0005]本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的，一种几丁质酶突变体
ChiM
‑
BL
及其应用，其核苷酸序列如
SEQIDNO.1
所示，氨基酸序列如
SEQIDNO.2
所示，在应用时，含有上述编码基因的重组表达载体
pPICZ
α
A
‑
chimbl
，和含有权利上述编码基因的重组毕赤酵母工程菌株
。
[0006]并在进行实现时，包括以下步骤：
[0007](1)
分析几丁质酶
ChiM
蛋白内部不同功能域，确定几丁质结合区域和
linker
肽段区域；
[0008](2)
优化几丁质酶
ChiM
几丁质结合区域，获得最佳融合突变体
ChiM
‑
ChBD6
；
[0009](3)
在最佳融合突变体
ChiM
‑
ChBD6
的基础上对
linker
肽段进行突变优化，获得突变体
ChiM
‑
BL
；
[0010](4)
测定了重组突变体
ChiM
‑
BL
的酶学特性；
[0011](5)
突变体
ChiM
‑
BL
酶法制备几丁质寡糖
。
[0012]本专利技术的技术效果和优点：通过理性设计获得酶催化效率提升的几丁质酶突变体
ChiM
‑
BL
并对其进行特性表征，为其产业化应用奠定基础
。
附图说明
[0013]图1重组突变体
ChiM
‑
BL
最适反应温度
(A)
及热稳定性图
(B)。
[0014]图2重组突变体
ChiM
‑
BL
最适反应
pH(A)
及
pH
稳定性图
(B)。
[0015]图3不同反应时间水解产物几丁质寡糖浓度
(A)
和水解率
(B)。
具体实施方式
[0016]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚
、
完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例
。
基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围
。
[0017]请参阅图1‑3所示，一种几丁质酶突变体
ChiM
‑
BL
及其应用，在进行实施时，步骤如下：
[0018]1、
菌株与载体
[0019]大肠杆菌菌株
Top10、
毕赤酵母
X33
均从商业途径购买获得，表达载体
pPICZ
α
A
‑
chim
前期实验构建
。
[0020]其中，载体
pPICZ
α
A
的基因序列信息可参见网址：
https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/V19520
？
ICID
＝
search
‑
product
，表达载体
pPICZ
α
A
‑
chim
的基因序列信息如下所示
。
其中，双直线下划线的为启动子5’
AOX1
序列信息，虚线下划线的为
α
信号肽序列信息，划波浪线部分为
chim
基因的序列信息，直线下划线的为
Zeocin
抗性基因序列信息
。
[0021][0022][0023][0024][0025]2、
酶与试剂盒
[0026]Q5
高保真
Taq
酶
MIX
购自
NEB
公司；质粒提取，胶纯化试剂盒购自天根生化科技
(
北京
)
有限公司；限制性内切酶购自宝日医生物技术
(
北京
)
有限公司；
Zeocin
购自
Invitrogen
公司
。
[0027]3、
培养基
[0028]大肠杆菌培养基为
LB(1
％
(w/v)
蛋白胨，
0.5
％
(w/v)
酵母提取物，1％
(w/v)NaCl<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种几丁质酶突变体
ChiM
‑
BL
，其特征在于：其核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，氨基酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。2.
一种几丁质酶突变体
ChiM
‑
BL
的应...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建荣，祝木金，陈微，王平，陈孟林，钟斌，高美芳，曹革，
申请(专利权)人：深圳润康生态环境股份有限公司，
类型：发明
国别省市：