BglD2制造技术

本发明专利技术提供了一种

【技术实现步骤摘要】
BglD2突变体、BglD2突变酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种
BglD2
突变体
、
核酸分子
、
重组质粒
、
宿主细胞
、BglD2
突变酶及其制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]白藜芦醇是一种有着重要作用的多酚类化合物，其在医疗医药
、
化妆品
、
保健品与食品领域有着广大的应用和开发领域
。
然而，现阶段白藜芦醇的产量却远不能满足市场的需求
。
研究表明，利用
β
‑
葡萄糖苷酶水解虎杖苷是制备白藜芦醇的重要方法之一，然而
β
‑
葡萄糖苷酶存在热稳定性差
、
乙醇耐受差等问题
。
来源于海洋细菌
Bacillus sp.D1
的
β
‑
葡萄糖苷酶
BglD2
对乙醇有着很好的耐受性，且有较高的葡萄糖耐受性和较高的催化水解虎杖苷的能力，其可以在较低温度下高效水解虎杖苷生产白藜芦醇
。
[0003]存在的问题是：
BglD2
的热稳定性差，这限制了该酶的大规模应用
。

技术实现思路

[0004]本专利技术解决了
BglD2
热稳定性差的技术问题，实现了提高
BglD2
热稳定性的技术效果
。
[0005]为解决上述问题，本专利技术提供一种
BglD2
突变体，
BglD2
突变体为单一位点的点突变，突变点为
D156、D411
中的任意一个
。
[0006]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术通过分析
BglD2
的氨基酸组成特征
、NetSurfP
预测
、
多重序列比对
、
分子对接
、SIFT
预测和
Pymol
分析突变前后相互作用力的变化，以保护保守性位点和避免有害突变为原则，最终筛选出突变点
。
[0007]在本专利技术的一个实例中，
BglD2
突变体的突变点为
D156
，
BglD2
突变体
D156E
的氨基酸序列如
SEQ ID NO:1
所示
。
[0008]在本专利技术的一个实例中，
BglD2
突变体的突变点为
D411
，
BglD2
突变体
D411E
的氨基酸序列如
SEQ ID NO:2
所示
。
[0009]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：通过上述突变点，本专利技术提供的
BglD2
突变体的热稳定性和酶活性均有所提高
。
[0010]本专利技术还提供一种核酸分子，核酸分子编码上述任一实例的
BglD2
突变体
。
[0011]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术提供的核酸分子具有
BglD2
突变体的所有有益效果，在此不再赘述
。
[0012]本专利技术还提供一种重组质粒，重组质粒包含上述实例的核酸分子
。
[0013]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术提供的重组质粒具有核酸分子的所有有益效果，在此不再赘述
。
[0014]本专利技术还提供一种宿主细胞，宿主细胞包含上述实例的重组质粒
。
[0015]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术提供的宿主细胞具有重组质粒的所有有益效果，在此不再赘述
。
宿主细胞可以是大肠杆菌细胞
。
[0016]本专利技术还提供一种
BglD2
突变酶的制备方法，包括以下步骤：根据
BglD2
基因序列，设计权利要求1所述的
BglD2
突变体的突变引物，采用同源重组的方法，以含有
BglD2
野生型序列的
pET
‑
22b(+)
质粒为模板，在
BglD2
引入目的位点进行定点突变，获得重组产物；将重组产物转化至感受态细胞，构建表达菌株；诱导表达表达菌株，并进行纯化，得到
BglD2
突变酶
。
[0017]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：上述制备方法操作简单，且制备得到的
BglD2
突变酶具有
BglD2
突变体的所有有益效果，在此不再赘述
。
根据
BglD2
基因序列，引物设计方式为：
5'
‑
15
‑
21bp
反向互补区域
+
至少
15bp
的非互补区域
‑
3'
，进行定点突变，
PCR
定点突变技术具有突变回收率高
、
可在任何位点引入突变
、
材料和试剂容易获得
、
操作简单等优势
。
[0018]本专利技术还提供一种
BglD2
突变酶，采用上述任一实例的制备方法制备得到
。
[0019]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术提供的
BglD2
突变酶的热稳定性和酶活性较
BglD2
野生型均有所提高
。
[0020]本专利技术还提供一种上述实例的
BglD2
突变酶的应用，应用于制备白藜芦醇
。
[0021]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本专利技术提供的
BglD2
突变酶能够高效水解虎杖苷制备白藜芦醇，且热稳定性高
。
[0022]采用本专利技术的技术方案后，能够达到如下技术效果：
[0023](1)
本专利技术通过理性设计方法，寻找影响野生型
BglD2
热稳定性的氨基酸位点，并对位点进行有选择的替换，经过初筛和复筛分别测定野生酶和突变酶的各项参数，从而得到热稳定性提高且酶活力不受负面影响的突变体
。
[0024](2)
本专利技术提供的
D156E、D411E
突变体的热稳定提高，以虎杖苷为底物，
D156E
突变体在
40℃
时的半衰期
(T
(1/2,40℃)
)
由
27.41
分钟延长到
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
BglD2
突变体，其特征在于，所述
BglD2
突变体为单一位点的点突变，突变点为
D156、D411
中的任意一个
。2.
根据权利要求1所述的
BglD2
突变体，其特征在于，所述
BglD2
突变体的突变点为
D156
，
BglD2
突变体
D156E
的氨基酸序列如
SEQ ID NO:1
所示
。3.
根据权利要求1所述的
BglD2
突变体，其特征在于，所述
BglD2
突变体的突变点为
D411
，
BglD2
突变体
D411E
的氨基酸序列如
SEQ ID NO:2
所示
。4.
一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1‑3中任一项所述的
BglD2
突变体
。5.<...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐莉莉，王进波，曹飞强，
申请(专利权)人：浙大宁波理工学院，
类型：发明
国别省市：