一种用于制备生物汽油的工程大肠杆菌制造技术

一种用于制备中碳脂肪醇的工程大肠杆菌和制备中碳脂肪醇的方法，该方法通过在大肠杆菌中过量表达硫脂酶基因，脂酰－ＣｏＡ还原酶基因和脂肪醛脱羧酶基因等，使大肠杆菌获得生产生物汽油的能力，结合过量表达乙酰－ＣｏＡ羧化酶基因并敲除大肠杆菌的脂酰－ＣｏＡ脱氢酶基因，进一步提高工程大肠杆菌的生物汽油的生产能力。该方法可用于新一代生物汽油的的生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于制备生物汽油的工程大肠杆菌。本专利技术还涉及利用上述工程大肠杆菌制备生物汽油的方法。
技术介绍
随着石油资源的日益减少和环境污染的日益加剧，生物液体燃料作为一种清洁的 可再生能源，正受到世界各个国家的关注和重视。目前发展比较成熟的生物液体燃料包括 生物乙醇和生物柴油(脂肪酸甲酯)，但乙醇的能量密度低，易吸水，不方便储存和运输， 而生物柴油的黏度较大，容易凝固，会导致柴油机过滤器容易堵塞以及低温启动性能不佳 (Atsumi etal.，2008 ；李春梅等，2008)。因此，有必要发展生物丁醇和生物汽油等新一代 生物液体燃料以克服现有生物液体燃料的不足。生物汽油和化石汽油的组成成分相同，均 为C8-C12的烷烃，因此利用生物汽油替代化石汽油不存在任何技术障碍。所生产的烷烃分 泌到菌体细胞外，可以直接从培养液中萃取获得，简化了分离工艺，可以有效地降低生产成 本。利用大肠杆菌生产生物汽油的主要技术路线是将大肠杆菌产生的脂肪酸逐步还 原为烷烃。大肠杆菌具有遗传背景清楚，生长速度快，可实现高密度培养的优点，因此可以 很好的用于代谢产物的生产。烷烃生产中很关键的一步是脂肪酸的生产，而乙酰_CoA到丙 二酰-CoA的转化，是脂肪酸生物合成中的限速酶。在大肠杆菌中过量表达乙酰_CoA羧化 酶可以加快其脂肪酸合成的速率，从而使其积累更多的脂肪酸。硫脂酶催化脂酰-ACP为游离脂肪酸，但是大肠杆菌自身的硫脂酶主要作用于 C16和C18的脂酰-ACP，因此它主要积累C16和C18的脂肪酸。而据报道，U. californica, C. calophy 1 la，C. hookeriana以及C. palustvis等生长的种子中积累癸酸和月桂酸等 中短链脂肪酸(Voelker et al.，1992，Filichkin et al.，2005，Dehesh et al.，1996， Katayoon et al.，1996)。因此，在大肠杆菌中过量表达U. californica的硫脂酶基因BTE， 或 C. calophylla 的 Cc FatB2，或 C. hookeriana 的 Ch FatB2，或 C. palustvis 的 Cp FatB!等 便可以获得中短链的脂肪酸。游离脂肪酸在大肠杆菌脂酰-CoA合成酶(fadD)的作用下活化为脂酰_CoA，它可 继续在脂酰-CoA脱氢酶(fadE)的作用下转化为烯酰-CoA，从而进入氧化途径。脂 酰-CoA是烷烃生物合成途径的一个中间物，有必要阻止脂酰-CoA进入降解代谢途径以积 累脂酰-CoA用于短链烷烃的合成。脂酰-CoA到烷烃的转化是在脂酰-CoA还原酶和脂肪醛脱羧酶的催化下完成的。 脂酰-CoA还原酶催化脂酰-CoA生成脂肪醛，反应需要NADP+的参与，而脂肪醛脱羧酶催 化脂酰醛脱羧生成烷烃，伴随C0的产生。但大肠杆菌自身并不存在这两个酶，需要表达外 源的脂酰-CoA还原酶基因(acrl)和脂肪醛脱羧酶基因(CER1)才能在大肠杆菌内完成脂 酰-CoA到烷烃的转化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于制备生物汽油的工程大肠杆菌。本专利技术的又一目的在于提供一种利用上述工程大肠杆菌制备中短链烷烃即生物 汽油的方法。为实现上述目的，本专利技术提供的用于制备生物汽油的工程大肠杆菌，通过下述方 法得到通过PCR(聚合酶链式反应)扩增乙酰-CoA羧化酶基因、硫脂酶基因、脂酰_CoA 还原酶基因和脂肪醛脱羧酶基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后分别双酶切目的片 段和原核表达载体pET-30a(+)或pACY⑶uet-1，载体片断胶回收后，将载体基因片段按 摩尔比为1-2 4-5的比例混合，加入T4 DNA连接酶后4-7°C连接15-30小时，连接产物 38-42°C热击转化E.coli DH5a感受态细胞，涂布平板培养过夜，PCR筛选阳性克隆；阳性 克隆提取质粒DNA，酶切和测序鉴定后，热击转化E. coliBL21 (DE3)，最后敲除该工程大肠 杆菌的fadE基因后即得目标工程大肠杆菌。硫脂酶基因为来源于Umbellularia californica的BTE基因，或来源于Cuphea calophylla的Cc FatB2基因，或来源于Cuphea hookeriana的Ch &182基因，或来源于 Cuphea palustvis 的 Cp FatB!基因，或同 BTE，Cc FatB2，Ch FatB2 和 Cp FatB!同源性超过 70%的DNA序列。脂酰-CoA还原酶基因为来源于Acinetobacter calcoaceticus的acrl基因，或 同acrl基因同源性超过70%的DNA序列。脂肪醛脱羧酶基因为来源于Arabidopsis thaliana的CER1基因，或同CER1基因 同源性超过70%的DNA序列。乙酰-CoA羧化酶基因为来源于A. calcoaceticus的accABCD基因，或来源于 E. coli 白勺 accABCD , ^jftiJIT- Corynebacterium glutamicum 白勺 dtsRl-accBC ^； 同这些基因同源性超过70 %的DNA序列。脂酰-CoA脱氢酶基因为大肠杆菌的fadE基因。本专利技术提供的利用上述工程大肠杆菌制备中短链烷烃即生物汽油的方法，是将构 建好的工程大肠杆菌以1-2 100-130的比例接种内含卡那霉素和氯霉素的M9液体培养 液中，35-37°C，225rpm条件下培养至OD600nm为0. 6-0. 8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为 0. 1-0. 2mmol化―1，诱导目的蛋白的过量表达，然后转入28_30°C，225rpm继续培养18-24小 时；培养后的菌液离心取上清液，用等体积的正己烷萃取，减压蒸发除去正己烷后制得生物 汽油。与公知技术相比，本专利技术具有以下优点1)所生产的生物汽油为C8_C12的烷烃，和化石汽油组分相同。2)烷烃分泌到胞外，并达到了较高的浓度，便于分离。3)所获工程大肠杆菌能高效利用半纤维素和纤维素水解得到所有碳水化合物，对 解决生物质经济中“全糖转化利用”很有价值。附图说明图1是在实施例1中构建pA-accAB⑶表达载体过程的示意图2是在实施例1中构建pET-acrl/BTE/CERl表达载体过程的示意图。 具体实施例方式本专利技术是通过在大肠杆菌中过量表达乙酰-CoA羧化酶，硫脂酶，脂酰_CoA还原酶 和脂肪醛脱羧酶，并失活大肠杆菌的脂酰-CoA脱氢酶，使大肠杆菌能够高效地将糖类转化 为C8-C12的中短链烷烃。本专利技术中具有烷烃生产能力的工程大肠杆菌，通过以下方法构建而成通过PCR 扩增乙酰-CoA羧化酶基因，硫脂酶基因，脂酰-CoA还原酶基因和脂肪醛脱羧酶基因，用 胶回收试剂盒回收目的片段，然后分别双酶切目的片段和原核表达载体pET-30a(+)或 pACY⑶uet-1，载体片断胶回收后，将载体基因片段按摩尔比为1 5的比例混合，加入T4 DNA连接酶后4°C连接过夜，连接产物42°C热击转化E. coli DH5 a感受态细胞，涂布平板培 养过夜，PCR筛选阳性克隆。阳性克隆提取质粒DNA，酶切和测序鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备生物汽油的工程大肠杆菌，通过下述方法得到　　通过聚合酶链式反应扩增乙酰－ＣｏＡ羧化酶基因、硫脂酶基因、脂酰－ＣｏＡ还原酶基因和脂肪醛脱羧酶基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，然后分别双酶切目的片段和原核表达载体ｐＥＴ－３０ａ（＋）或ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１，载体片断胶回收后，将载体∶基因片段按摩尔比为１－２∶４－５的比例混合，加入Ｔ４ＤＮＡ连接酶后４－７℃连接１５－３０小时，连接产物３８－４２℃热击转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α感受态细胞，涂布平板培养过夜，ＰＣＲ筛选阳性克隆；阳性克隆提取质粒ＤＮＡ，酶切和测序鉴定后，热击转化Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３），最后敲除该工程大肠杆菌的ｆａｄＥ基因后即得目标工程大肠杆菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，杨建明，郑艳宁，刘炜，徐鑫，
申请(专利权)人：青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：95