一种海南斑等蝎抗菌肽及制备方法和应用技术

一种海南斑等蝎抗菌肽重组大肠杆菌，其特征在于：蝎毒抗菌肽重组大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　　ＤＨ５ａ／ＩｍＡＭＰ↓［１］，ＣＣＴＣＣ　　ＮＯ：Ｍ２０７０３４。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，本专利技术涉及一种海南斑等蝎毒抗菌肽，还涉及该抗菌肽基因的制备方法，同时还涉及该基因的用途，高活性抗菌肽的分子设计和抗菌功能鉴定。具体地说，本专利技术涉及一种海南斑等蝎抗菌肽基因的分离鉴定；涉及一种蝎抗菌肽的抗菌谱鉴定采用化学合成手段生产的海南斑等蝎毒抗菌肽对革兰氏阳性菌具有广谱抗性，而革兰氏阴性菌无作用；涉及蝎抗菌肽对临床分离的耐药溶血性葡萄球菌有效；还涉及一种蝎抗菌肽的高活性分子设计和抗菌功能鉴定分子设计的蝎抗菌肽不但提高了对革兰氏阳性菌的抑菌效果，而且对革兰氏阴性菌也有了抗性，具有潜在抗菌药物开发的价值。
技术介绍
抗生素耐药性问题已成为全球关注的焦点。中国是世界上滥用抗生素较为严重的国家，耐药菌引起的医院感染人数，已占到住院感染患者总人数的百分之三十左右。耐药菌另一个危害是可以在不同地区、国家之间的人群之间传播。肺炎链球菌是引起细菌性肺炎的常见病源菌，近年来肺炎链球菌对抗生素耐药性呈上升趋势，并已出现多重耐药菌株，是临床感染控制中棘手的难题。大量研究表明，在感染病菌或可能导致病菌感染(注射细菌或真菌，体壁损伤等)的情况下，昆虫能快速合成大量抗菌肽，迅速杀灭已侵入的病菌，并阻止病菌的继续侵染。到目前为止，在昆虫中已发现了大量的抗细菌肽，抗真菌肽，以及既抗真菌又抗细菌的抗菌肽。这些抗菌肽不仅对细菌、真菌有广谱抗菌能力，对病毒、原虫及癌细胞也有作用。此外，还有作用机制独特，对高等动物正常细胞无害等特点，在面临抗药性和筛选新的抗生素极端困难的情况下，昆虫抗菌肽可能成为抗生素的新来源。蝎子是我国的一种传统名贵中药，2000多年前就记载了蝎子的药用史。明朝《本草纲目》更详细记载蝎主治“诸风瘾疹、中风、半身不遂、口眼歪斜、语涩、手足抽挚，小儿惊痫风搐”等多种疾病，具有抗肿瘤，杀虫，抑菌和抗菌功效，其作用主要来源于蝎尾毒腺分泌的毒液。毒液的主要成分是一类由10-100个氨基酸组成的具有多种生物活性的小分子多肽，它们可以选择性、特异性的与细胞膜上的膜蛋白相互作用，从而改变细胞对离子的通透能力，调节细胞体积、pH、膜电位、兴奋性等多种细胞代谢过程和细胞分泌、激素作用和信号转导等多种生理过程。据估计，约有100000种不同生物活性肽存在于各种蝎毒腺中。因此，蝎毒素具有重要的理论研究意义和应用开发价值。对东亚钳蝎有实验研究表明，全蝎乙醇提取物在体外对8种表浅致病真菌均有抑制作用，尤其对裴氏着色菌、中克氏孢子丝菌、石膏样毛癣菌、絮状表皮癣菌较为敏感，其抗真菌作用优于大蒜浸出液。曾宪春等从我国东亚钳蝎毒腺中分离到了一个抗菌肽基因BmKn2，发现该蝎毒肽具有抗大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的功能(Zeng X C，Wang S X，Zhu Y，Zhu S Y，Li W X.Identification andfunctional characterization of novel scorpion venom peptides with nodisulfide bridge from Buthus martensii Karsch.Peptides，2004，25143-150.)，本专利技术获得的ImAMP1是从海南斑等蝎毒腺中分离的一新基因。同时，目前涉及海南斑等蝎毒素基因的专利还没有，而涉及东亚钳蝎毒腺毒素基因的专利仅有7项①东亚钳蝎毒素BmKAS在制药中的应用，该专利技术涉及东亚钳蝎毒素BmKAS在制备抗外周伤害药中的应用，以及东亚钳蝎毒素BmKAS在制备抗痛觉过敏药中的应用；②一种含有双价抗虫基因的重组杆状病毒，该专利技术涉及东亚钳蝎昆虫特异性神经毒素基因BmKIT与一种昆虫几丁质酶基因(Chi)，获得含双价抗虫基因的重组杆状病毒AcNPV-BmKIT-Chi；③蝎抗心律失常肽重组大肠杆菌及其构建方法，该专利技术涉及了一种蝎抗心律失常肽BmKIM基因重组大肠杆菌，用于大量生产可溶、具有抗心律失常活性的重组肽；④蝎抗心律失常肽及其制备方法和应用，该专利技术公开了一种蝎抗心律失常肽BmKIM及其制备方法和应用，本专利技术所得到的重组BmKIM多肽具有高效抗心律失常活性，且可溶性好，产量高；⑤一种人工合成的蝎氯离子通道神经毒素基因-rBmKCTa，该专利涉及到氯离子通道神经毒素BmKCT基因，采用基因工程所得的改良的重组蝎氯离子通道神经毒素对神经胶质细胞具有抑制作用，可用于制备通过抑制神经胶质细胞可以治疗的疾病的药物；⑥一种过渡型蝎毒素BmKabT的用途，本专利技术公开了的过渡型蝎毒素BmKabT的用途，它可以作为一个独特的钠通道调制剂，研究钠通道组成、结构和功能的探针，可调节和治疗钠通道相关疾病的调制剂和药品，可制备调节或治疗高血钾性麻痹、先天性肌强直及其它骨骼肌疾病、第三类长QT间隔症(LQT3)、原发性心室纤颤及其他心脏疾病的调制剂或药品；⑦一种重组蝎昆虫毒素及其可溶性表达和纯化方法，该专利技术涉及一种重组蝎昆虫毒素rBmKIT及其可溶性表达和纯化方法。尽管①②③④⑤⑥⑦专利都是关于东亚钳蝎毒素的内容，而本专利技术中所使用的蝎子为海南斑等蝎，专利涉及的蝎毒素基因BmKAS、BmKIT、BmKIM、BmKCT、BmKabT与本专利技术获得的ImKAMP1基因是完全不同的毒素基因，并且①②③④⑤⑥⑦专利专利技术都没有涉及到蝎毒素的抗菌功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供一种海南斑等蝎抗菌肽基因，具有抗菌功能。本专利技术的另一个目的还在于提供一种海南斑等蝎蝎毒抗菌肽，抗菌效果佳。本专利技术的再一个目的是在于提供一种制备的海南斑等蝎抗菌肽的方法，方法易行，操作简单，制备的突变体提高了抗菌效果。本专利技术的再一个目的是在于提供一种海南斑等蝎抗菌肽在制备治疗或预防革兰氏细菌的药物中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施①构建了一个高质量海南斑等蝎毒腺组织cDNA文库，首先取海南斑等蝎的毒腺；其次是提取总RNA，并纯化mRNA；第三是反转录合成双链cDNA；第四是双链cDNA与载体pSPORT1的连接(采用T4DNA连接酶)；第五是重组分子的电转化；第六是获得毒腺细胞cDNA文库；②以第一步毒腺组织cDNA文库为基础，通过PCR的方法筛选到了一个克隆子A165(编号)，序列分析为一种抗菌肽基因，命名为ImAMP1，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国.武汉.武汉大学，保藏日期2007年4月3日，保藏编号CCTCC NOM207034，分类命名大肠杆菌DH5α/ImAMP1(Escherichia coli DH5α/ImAMP1)；③采用化学合成的方法(由上海科肽生物科技有限公司合成)，获得了蝎毒抗菌肽ImAMP1，抗菌试验结果表明，ImAMP1对革兰氏阳性细菌苏云金芽孢杆菌(最小抑菌浓度MIC为25μg/ml)、枯草芽孢杆菌(MIC为50μg/ml)、金黄色葡萄球菌(MIC为25μg/ml)具有不同浓度的抑制作用，而对革兰氏阴性细菌大肠杆菌(100μg/ml无作用)和铜绿假单胞菌(100μg/ml无作用)无效。该蝎毒抗菌肽ImAMP1对革兰氏阳性细菌具有特异性；④分子设计了ImAMP1的突变体ImAMP1-M，抗菌试验表明，该蝎毒抗菌肽的突变体ImAMP1-M提高了对革兰氏阳性菌(对枯草芽孢杆菌MIC为25μg/ml和对金黄色葡萄球菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海南斑等蝎抗菌肽重组大肠杆菌，其特征在于：蝎毒抗菌肽重组大肠杆菌ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５ａ／ＩｍＡＭＰ↓［１］，ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｍ２０７０３４。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹志贱，李文鑫，吴英亮，马一保，戴潮，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83