公开了包含染色体上失活的ｔｄｃＢＣ和ｐｃｋＡ基因的微生物，其由于这两个基因的失活可显著地提高Ｌ－苏氨酸的产量。本发明专利技术也公开了利用该微生物生产Ｌ－苏氨酸的方法。该微生物通过重组技术将抗生素抗性基因导入含有失活的、Ｌ－苏氨酸降解相关操纵子基因ｔｄｃＢＣ的细菌菌株的染色体上的ｐｃｋＡ基因中而得以制备。该微生物具有由于ｔｄｃＢＣ操纵子基因的失活而防止Ｌ－苏氨酸降解和胞内流入的作用，并包含Ｌ－苏氨酸生物合成的多种活化途径。由于甚至在高浓度葡萄糖的存在下能高水平和高产量地产生Ｌ－苏氨酸，因此该微生物可用于Ｌ－苏氨酸的大量生产。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种产生L-苏氨酸的微生物和一种利用该微生物生产L-苏氨酸的方法。更具体地说，本专利技术涉及一种包含染色体上失活的tdcBC和pckA基因以及由于这两个基因的失活而显著地提高L-苏氨酸的产量的微生物，以及利用所述的微生物生产L-苏氨酸的方法。
技术介绍
L-苏氨酸以作为必需氨基酸为人所知，其已经广泛地用作动物饲料和食物的添加剂、动物生长的刺激剂，以及药物水溶液的组分和其它用于医药产品的原料。目前L-苏氨酸仅仅在包括日本的Ajinomoto公司在内的发达国家的五家公司得以生产，并且比赖氨酸昂贵两至三倍，所述赖氨酸由于其在国际市场上每吨5,000-6,000美元的高价而为人所知是非常贵重的。因此，L-苏氨酸具有在世界市场上的高增长潜力。目前L-苏氨酸仅仅通过主要利用来源于野生型微生物的突变株，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、沙雷氏菌属(Serratia)和普罗威登斯菌属(Providencia)的微生物发酵技术得以生产。这些突变株的实例包括对氨基酸类似物或药物具有抗性的突变株，以及它们的用于二氨基-庚二酸、甲硫氨酸、赖氨酸和异亮氨酸的营养缺陷型(日本专利公开No.平成2-219582；韩国专利申请No.1998-32951；Appl.Microbiol.Biotechnol.，29550-553，1988)。然而，由于它们对二氨基-庚二酸或异亮氨酸的营养缺陷型的性状，就其具有低L-苏氨酸产量和仅在补充了昂贵的二氨基-庚二酸或异亮氨酸的培养基中得以生长而言，所述的突变株是不适宜的。也就是说，在利用生长需要二氨基-庚二酸的突变株的情况下，L-苏氨酸的发酵生产需要高成本。同样地，如果利用异亮氨酸营养缺陷型，用于该营养缺陷型的发酵培养基必须补充昂贵的异亮氨酸，导致增加L-苏氨酸的生产成本。这些问题通过使用异亮氨酸渗漏突变型得以解决，如韩国专利公开No.92-8365中公开的，其在培养基中不需要异亮氨酸以及比已知菌株产生更高水平的L-苏氨酸。然而，该传统的突变方法在选择能产生高水平的L-苏氨酸的新细菌菌株方面也是费时和低效的，并具有限制L-苏氨酸产量提高的最大缺点。在这方面，不使用营养缺陷型并用于大量生产L-苏氨酸的其它的方法已经得以发展，该方法使用L-苏氨酸生产微生物的重组体，所述微生物通过代谢遗传工程技术提高了参与L-苏氨酸生物合成的酶的活性。也就是说，对应于参与L-苏氨酸代谢的酶的基因通过使用遗传重组技术得以分离、克隆入合适的基因载体，以及导入微生物突变株来提高该突变株的L-苏氨酸产量。本专利技术者以前开发了利用所述的代谢遗传工程技术来研制L-苏氨酸生产菌株的方法，如韩国专利申请No.2001-6976所公开的。具体地脱，L-苏氨酸的高产量可通过使用重组体微生物得以实现，该微生物在染色体上具有一个或多个拷贝的编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因(在下文中，简称为″ppc″)和操纵子，所述羧化酶可催化作为由磷酸烯醇丙酮酸(PEP)起始的L-苏氨酸生物合成的前体的草酰乙酸(OAA)的形成，所述操纵子包括编码三种参与由天冬氨酸起始的L-苏氨酸生物合成的酶，即天冬氨酸激酶1-高丝氨酸脱氢酶(thrA)、高丝氨酸激酶(thrB)和苏氨酸合酶(thrC)的基因。L-苏氨酸经由多步骤途径从天冬氨酸得以合成，其中天冬氨酸由OAA形成，而OAA则从PEP通过PPC转化而来。当葡萄糖以较高水平存在于培养基时，与细菌生长速率和TCA循环的总速率相比，L-苏氨酸生物合成受到抑制。在该情况下，ppc基因表达受到抑制，而编码催化OAA转化为PBP的PEP羧基激酶(在下文中，简称为″pckA″)的基因的表达得到提高。增加的pckA水平导致PEP从作为氨基酸生物合成的前体的OAA的形成，其中其它的副产物从PEP得以合成(Goldie H.Medina V.，Mol.Gen.Genet.，220(2)191-196，1990；Dang等人，E.coli and Salmonella，1191-102，1996)。因此，pckA基因应当基本上受到失活，以便通过增加负责L-苏氨酸合成的代谢途径的通量来高水平生产L-苏氨酸。另一方面，已经知道用于L-苏氨酸降解的几种途径，其中包括下列三种途径。其一涉及由苏氨酸脱氢酶起动的产生α-氨基β-丁酮酸的途径。α-氨基-β-丁酮酸可被转化为乙酰辅酶A和甘氨酸，或被自然降解为可转化为丙酮酸的氨基丙酮。第二种途径涉及苏氨酸脱水酶产生α-丁酮酸，其中α-丁酮酸进一步被分解代谢为丙酰辅酶A并最终代谢为TCA循环中间体，琥珀酰辅酶A。第三种途径利用苏氨酸醛缩酶(Neidhardt F.C.等人，Escherichia coli andSalmonellacellular and molecular biology，第二版，ASM出版社，Washington DC，pp369-370)。在它们之中，苏氨酸脱水酶是可在缺氧和高含量苏氨酸下表达的操纵子。通过经由遗传重组技术特异失活该操纵子基因(tdcBC)(韩国专利申请No.2002-015380)，本专利技术者研制了L-苏氨酸产量得到提高的微生物。在另一方面，国际专利公开No.WO 02/29080 A2公开了利用pckA基因缺陷的微生物生成L-苏氨酸的方法，该微生物通过将携带部分缺失pckA基因的重组载体导入该微生物的野生型菌株得以制备。然而，至于L-苏氨酸的产量该微生物是有问题的，因为在该微生物中用于合成的L-苏氨酸的降解和胞内流入的途径依旧是激活的。为了解决现有技术中遇到的问题，对于制备即使当生长在含有高浓度的葡萄糖的培养基中也能产生高水平的L-苏氨酸和并不降解所产生的L-苏氨酸的微生物的方法，本专利技术者进行了充分和彻底的研究而获得本专利技术，结果发现当微生物染色体的pckA基因通过遗传重组技术得以失活时，本专利技术者研制的tdcBC操纵子-基因剔除的微生物与常规的L-苏氨酸生产微生物相比提高了L-苏氨酸的产量。因此本专利技术的目的是提供能够有效地生产高水平的L-苏氨酸的微生物。
技术实现思路
为了达到以上目的，本专利技术提供了新的大肠杆菌菌株，其包含在染色体上失活的tdcBC和pckA基因。在tdcBC/pckA基因失活的大肠杆菌菌株中，pckA基因通过将两端各自含有抗生素抗性基因和位点特异性重组酶结合位点的外源pckA基因片段导入大肠杆菌菌株得以失活，所述大肠杆菌菌株含有L-苏氨酸降解相关操纵子，即失活的tdcBC，然后使得外源pckA基因片段和染色体上的pckA基因进行同源重组以失活染色体的pckA基因。此外，本专利技术提供了利用tdcBC/pckA基因失活的大肠杆菌菌株生产L-苏氨酸的方法。附图的简要说明本专利技术以上的和其它目的、特征和其它优势可从下列连同附图一起所作的详细描述中得以更加清楚地理解，其中附图说明图1是显示了克隆pckA基因的过程的示意图。图2是显示了制备重组体微生物的示意图，其中导入了含有氯霉素抗性基因(cat)和loxP位点的pckA基因片段(ΔpckA∷loxpcat)；和图3是显示了Southern印迹法的结果照片，其中发现氯霉素抗性基因(cat)被本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种包含被失活的ｔｄｃＢＣ和ｐｃｋＡ基因的大肠杆菌菌株。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：朴永薰，李炳春，金大哲，李珍镐，赵载熔，
申请(专利权)人：希杰株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]
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