【技术实现步骤摘要】
一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法
[0001]本专利技术涉及
，具体涉及一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法。
技术介绍
[0002]间充质干细胞(Mesenchymal Stem cell,MSCs)是具有高度自我更新能力、多向分化潜能的成体干细胞，起源于中胚层，最早在骨髓中发现，主要存在于结缔组织和器官间质中，在适合的诱导条件下能分化为多种间质组织，如骨骼、软骨、脂肪组织等。
[0003]胎盘(Placenta)是胎儿与母体之间物质交换的重要组织器官，由内至外分为羊膜层，绒毛膜层及蜕膜层，其中羊膜层是间充质干细胞重要来源之一。羊膜来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。
[0004]羊膜(Amniotic membrane)位于胎盘儿体面的最内层，无血管、神经和淋巴管分布，从内至外分别为：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。其中羊膜间充质干细胞存在于致密层等皮下层中。
[0005]目前，分离提取人羊膜间充质干细胞的常用方法是：两步酶消化法和组织块贴壁培养法。两步酶消化法是利用胰酶与胶原酶组合消化组织，分离获得单个细胞进行培养；组织块贴壁培养法是通过组织附着在培养器皿中，待细胞自行爬出后进行贴壁生长。
[0006]1)两步酶消化法的消化时间长，化学试剂对细胞伤害大，导致细胞形态较差，质量偏低，同时试剂成本高，不利于大规模分离培养；>[0007]2)组织块贴壁培养法的细胞爬出贴壁时间较长，培养过程中所收获的原代细胞数量少且纯度低，需多次纯化。
[0008]因此，所属领域技术人员仍需要进一步改进分离提取人羊膜间充质干细胞方法的必要性。
技术实现思路
[0009]本专利技术的目的是提供一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，用以解决传统方法的细胞培养周期过长，增殖速度过慢的问题，本专利技术将结合并优化两种方法以培养优质细胞。
[0010]本专利技术是采用以下的技术方案来实现的。
[0011]一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，包括以下工艺步骤：
[0012]1)清理
[0013]胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用止血钳取出胎盘至无菌托盘中，用含有100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水冲洗胎盘表面，去除残留的血液与其他杂物；
[0014]2)剥离
[0015]用钩镊从胎盘上剥取羊膜平铺于10cm培养皿中，用含有100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水将其清洗至半透明状，再剪成大小为3～4cm2的组织块；
[0016]3)消化
[0017]将羊膜块转入150mL储液瓶中，加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶后放入37℃、200rpm/min恒温摇床中消化30min于1200rpm/min离心5min并弃上清；再次加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶在相同条件下消化30min，两次消化过程中每隔10min取出储液瓶观察并剧烈摇晃，使羊膜块充分接触液体；此操作目的是消化上皮细胞等杂细胞，提高细胞纯度且有利于羊膜间充质干细胞爬出。
[0018]4)除杂
[0019]将消化好的组织混合液用70μm细胞筛网过滤，弃滤液，取出网中组织放置于10cm培养皿中，用生理盐水漂洗2次后用直剪剪碎成0.3cm2左右的组织块。
[0020]5)贴壁培养
[0021]将剪碎后组织块平铺于10cm培养皿中，倒置培养1～2h至组织紧贴培养皿后，正置培养皿并加入5mL培养基(友康胎盘间充质干细胞培养基，货号：NC0103)在37℃，5％CO2培养箱中培养，每2天换液1次。
[0022]6)差速消化与传代
[0023]所述组织原代分离培养间充质干细胞汇合度达85％后弃掉培养液，加入5mL PBS(PBS缓冲液(1X)，货号：PBS
‑
10001)清洗培养皿后吸出，缓慢加入1ml的0.25％胰蛋白酶消化细胞2分钟后吸出细胞悬液至50mL离心管终止消化(无需冲洗培养皿底部细胞)，1200rpm/min离心5min，弃上清，加入20ml友康培养基吹打均匀，接种至T182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；此操作的特点是利用消化时间差，使收集到的羊膜间充质干细胞纯度更高。
[0024]7)除杂与细胞二次爬出
[0025]向步骤6)中含有贴壁羊膜组织块的培养皿中再次加入0.25％胰蛋白酶消化细胞5分钟，用移液管轻轻吹散培养皿底部细胞并弃掉，用生理盐水缓慢清洗培养皿底部2次，加入5mL友康培养基使组织二次爬出间充质干细胞，待细胞汇合度达85％时，按步骤6)差速消化细胞，接种至T182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；此操作的特点是去除初次贴壁爬出的杂细胞，同时重复利用组织块获得大量原代细胞。
[0026]8)大量培养
[0027]步骤6)与步骤7)收获的P1代细胞再次经过差速消化，接种培养后，获得P2代羊膜间充质干细胞。
[0028]9)传代培养
[0029]P2代羊膜间充质干细胞汇合度达85％后，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆未脱落时，用移液管冲洗T182培养瓶底部收集细胞终止消化后于1200rpm/min离心5min，将细胞沉淀用培养液重悬接种培养后，获得P3代间充质干细胞。待P3代间充质干细胞汇合度达85％后，收集P3代细胞。
[0030]优选地，上述从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，步骤6)中，以3000cells/cm2的密度接种至7个T182培养瓶中，每瓶加入20ml友康培养基以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，记为P1代羊膜间充质干细胞；
[0031]此步骤培养的P1代细胞为A组，将4个T182培养瓶依次编号为A
‑①
，A
‑②
，A
‑③
，A
‑④
，A
‑⑤
，A
‑⑥
及A
‑⑦
。
[0032]优选地，上述从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，步骤7)中，按步骤6)差速消化细胞，以3000cells/cm2的接种密度接种至7个T182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，记为P1代羊膜间充质干细胞；记录爬出时间以及细胞汇合度达85％时间；
[0033]此步骤培养的P1代细胞为B组，将7个T182培养瓶依次编号为B
‑①
，B
‑②
，B
‑③
，B
‑④
，B
‑⑤
，B
‑⑥
及B
‑⑦
。
[0034]优选地，上述从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，步骤8)中本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤：1)清理胎儿成功分娩后，无菌条件下获取胎盘组织，用止血钳取出胎盘至无菌托盘中，用含有100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水冲洗胎盘表面，去除残留的血液与其他杂物；2)剥离用钩镊从胎盘上剥取羊膜平铺于10cm培养皿中，用含有100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的生理盐水将其清洗至半透明状，再剪成大小为3～4cm2的组织块；3)消化将羊膜块转入150mL储液瓶中，加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶后放入37℃、200rpm/min恒温摇床中消化30min，于1200rpm/min离心5min并弃上清；再次加入羊膜总体积1.5倍的0.25％胰蛋白酶，在相同条件下消化30min，两次消化过程中每隔10min取出储液瓶观察并剧烈摇晃，使羊膜块充分接触液体；4)除杂将消化好的组织混合液用70μm细胞筛网过滤，弃滤液，取出网中组织放置于10cm培养皿中，用生理盐水漂洗2次后用直剪剪碎成0.3cm2左右的组织块；5)贴壁培养将剪碎后组织块平铺于10cm培养皿中，倒置培养1～2h至组织紧贴培养皿后，正置培养皿并加入5mL培养基在37℃，5％CO2培养箱中培养，每2天换液1次；6)差速消化与传代所述组织原代分离培养间充质干细胞汇合度达85％后弃掉培养液，加入5mL PBS清洗培养皿后吸出，缓慢加入1ml的0.25％胰蛋白酶消化细胞，2分钟后吸出细胞悬液至50mL离心管终止消化，1200rpm/min离心5min，弃上清，加入20ml友康培养基吹打均匀，接种至T182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；7)除杂与细胞二次爬出向步骤6)中含有贴壁羊膜组织块的培养皿中再次加入0.25％胰蛋白酶消化细胞5分钟，用移液管轻轻吹散培养皿底部细胞并弃掉，用生理盐水缓慢清洗培养皿底部2次，加入5mL友康培养基使组织二次爬出间充质干细胞，待细胞汇合度达85％时，按步骤6)差速消化细胞，接种至T182培养瓶中以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；8)大量培养步骤6)与步骤7)收获的P1代细胞再次经过差速消化，接种培养后，获得P2代羊膜间充质干细胞；9)传代培养。2.如权利要求1所述的从人胎盘中分离提取羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤6)中，以3000cells/cm2的密度接种至7个T182培养瓶中，每瓶加入20ml友康培养基以十字交叉法晃匀，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，记为P1代羊膜间充质干细胞；此步骤培养的P1代细胞为A组，将4个T182培养瓶依次编号为...
【专利技术属性】
技术研发人员：李文东，杜文敬，
申请(专利权)人：广东华夏健康生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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