一种关节修复蛋白组合物及其制备方法和其应用技术

本发明专利技术涉及一种关节修复功效蛋白组合物，其制备包括如下步骤：在细胞蛋白提取物中加入20U/mL

【技术实现步骤摘要】
一种关节修复蛋白组合物及其制备方法和其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种具有关节修复蛋白组合物及其制备方法和其应用。

技术介绍

[0002]老年人关节损伤及退行性病变或软骨损伤等问题呈现逐年递增。关节损伤(如关节外伤性病变、退变性骨关节病变等)为临床常见病症，包括难愈性创面病变、膝关节骨性关节病变、膝关节软骨磨损、软骨损伤等。
[0003]关节损伤及关节软骨损伤的治疗或修复方式包括消炎、镇痛(止痛)、理疗、针灸、关节置换、干细胞治疗、射频消融、软骨细胞移植、骨软骨移植、工程软骨，如以中医理疗和氨糖为代表的的物理治疗和营养、以几丁糖和透明质酸为代表的润滑缓解、以PRP为代表的抗炎治疗、以及关节镜和人工关节为代表的关节置换等，除关节置换外，均以缓解症状和延缓病程为主，缺乏真正有效且安全的治疗方式。
[0004]关节软骨没有血管、神经、淋巴系统分布，含有的软骨细胞量少、迁移与增殖能力有限，关节软骨损伤难以自愈。当关节软骨的血液供应和神经支配出现故障时易导致关节损伤，进而影响关节修复能力。如不进行及时的有效治疗和修复损伤，则损伤将继续加重并引发骨关节性病变，导致关节疼痛、关节肿胀或运动障碍，甚至由此导致不可逆的病理变化及关节退行性改变，影响患者的行动和致残。关节损伤修复是一个长期、渐进的缓慢过程。及时修复损伤细胞可以显著改善、治疗相关病变。
[0005]细胞及微生物受到外界刺激及外源应激物(包括冷、热、酸、碱、电流、辐射、化学物质等)应激诱导时会因应激反应而诱导细胞及微生物产生应激蛋白。文献1(New limonophyllines A
‑
C from the stem of Atalantia monophylla and cytotoxicity against cholangiocarcinoma and HepG2 cell lines，Arch.Pharm.Res.(2018)41:431
–
437)公开了从芸香科植物(Atalantia monophylla)提取制得的化合物1
‑
16具有抑制肿瘤细胞生长等活性。
[0006]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有自我复制和多向分化潜能，广泛存在于骨髓、脂肪、滑膜、牙髓、羊水、胎盘、脐带、胚胎、脐带血、羊膜、外周血、肌肉、尿液等组织，具有来源广泛、无需配型、感染率低、分化潜能强、增殖能力强、采集方便等特点，可产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、白介素
‑
6(IL
‑
6)、白介素
‑
7(IL
‑
7)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等活性因子，参与调节细胞生长、细胞凋亡、细胞分化、抗病毒、免疫成熟等过程，可用于免疫调节、组织修复及治疗急性肺损伤、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病。但MSCs产品需在其生产、储运和应用等环节采用冷藏方式，且其细胞活力保持≤12h，而限制其治疗应用。为此，需要开发安全有效的关节修复药物以满足临床需求。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种关节修复蛋白组合物，其制备包括下述步骤：
[0008](1)在本专利技术的细胞蛋白提取物中加入20U/mL
‑
35U/mL的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃
±
1℃条件下酶解15min
‑
40min，制得酶解液，将其置于2℃
‑
4℃条件下备用；
[0009](2)在2℃
‑
8℃条件下，将步骤(1)制得的酶解液用洗脱溶剂配置成5
‑
15mg/ml后，过色谱柱，洗脱流速为0.1
‑
1ml/min，监测并收集紫外波长为280nm的洗脱部位，即得，其中，洗脱溶剂由50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)中含300mmol/L氯化钠组成。
[0010]本专利技术优选的技术方案中，所述细胞蛋白提取物的制备包括如下步骤：
[0011]S
‑
1:将密度为5.0
×
106个/mL
‑
1.0
×
107个/mL的间充质传代细胞置于含有DMEM/F12 40
‑
50％、RPMI1640 40
‑
50％、牛血清蛋白(BSA)0.1
‑
2％、表皮细胞生长因子(EGF)1
‑
15ug/mL、成纤维细胞生长因子(FGF)1
‑
15ug/mL、胰岛素转铁蛋白1
‑
15ug/mL、复方氨基酸(18AA)0.01
‑
0.1％和2
‑
10μmol/L应激物的培养基中，再将其置于37.0℃
±
0.5℃、5％
±
1.0％CO2条件下培养10h
‑
14h后，分离，洗涤，收集细胞，其中，所述的应激物选自化合物1
‑
16的任一种或其组合，
[0012][0013][0014]S
‑
2:将收集细胞按照密度为5.0
×
106个/mL
‑
1.0
×
107个/mL分散于溶剂中，再将其置于2℃
‑
8℃下超声处理，制得细胞裂解液，其中，所述溶剂选自选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)、TBPS缓冲液、TBST缓冲液、Tris缓冲液的任一种或其组合；
[0015]S
‑
3:将步骤S
‑
2制得的细胞裂解液分离后，所得的分离液依次经0.45um、0.22um滤膜过滤，即得。
[0016]本专利技术的优选技术方案中，步骤S
‑
1的培养基中含有DMEM/F1242
‑
45％、RPMI1640 42
‑
45％、牛血清蛋白(BSA)0.5
‑
1.5％、表皮细胞生长因子(EGF)5
‑
10ug/mL、成纤维细胞生长因子(FGF)5
‑
10ug/mL、胰岛素转铁蛋白5
‑
10ug/mL、复方氨基酸(18AA)0.02
‑
0.05％和3
‑
8μmol/L的应激物。
[0017]本专利技术的优选技术方案中，步骤S
‑
1的培养基中含有DMEM/F1245％、RPMI1640 45％、牛血清蛋白(BSA)0.5％、表皮细胞生长因子(EGF)10ug/mL、成纤维细胞生长因子(FGF)10ug/mL，胰岛素转铁蛋白10ug/mL、复方氨基酸(18AA)0.05％和4
‑
6μmol/L的应激物。
[0018]本专利技术的优选技术方案中，步骤S...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种关节修复蛋白组合物，其制备包括下述步骤：(1)在细胞蛋白提取物中加入20U/mL
‑
35U/mL的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃
±
1℃条件下酶解15min
‑
40min，制得酶解液，将其置于2℃
‑
4℃条件下备用；(2)在2℃
‑
8℃条件下，将步骤(1)制得的酶解液用洗脱溶剂配置成5
‑
15mg/ml后，过色谱柱，洗脱流速为0.1
‑
1ml/min，监测并收集紫外波长为280nm的洗脱部位，即得，其中，洗脱溶剂由50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)中含300mmol/L氯化钠组成。2.如权利要求1所述的蛋白组合物，所述关节修复蛋白组合物的分子量为25kDa
‑
245kDa，优选为50kDa
‑
200kDa。3.如权利要求1
‑
2任一项所述的蛋白组合物，所述细胞蛋白提取物的制备包括如下步骤：S
‑
1:将密度为5.0
×
106个/mL
‑
1.0
×
107个/mL的间充质传代细胞置于含有DMEM/F12 40
‑
50％、RPMI 1640 40
‑
50％、牛血清蛋白(BSA)0.1
‑
2％、表皮细胞生长因子(EGF)1
‑
15ug/mL、成纤维细胞生长因子(FGF)1
‑
15ug/mL、胰岛素转铁蛋白1
‑
15ug/mL、复方氨基酸(18AA)0.01
‑
0.1％和2
‑
10μmo l/L应激物的培养基中，再将其置于37.0℃
±
0.5℃、5％
±
1.0％CO2条件下培养10h
‑
14h后，分离，洗涤，收集细胞，其中，所述的应激物选自化合物1
‑
16的任一种或其组合，
S
‑
2:将收集细胞按照密度为5.0
×
106个/mL<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宇，高文勇，陈琳，李建军，
申请(专利权)人：北京达尔文细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：