一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于肾损伤修复技术领域，涉及一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物及其制备方法和应用。本发明专利技术提供了一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物的制备方法，包括以下步骤：将人脐带间充质干细胞来源的细胞膜进行反复梯度挤压，得到人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物。本发明专利技术所述人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物能够抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡，以及转化生长因子

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于肾损伤修复
，具体涉及一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物(human umbilical cord mesenchymal stem cell
‑
derived extracellularvesicle mimetics，hucMSC
‑
EVM)及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]根据病因，肾脏疾病可分为原发性、继发性和先天性疾病。急性肾损伤(AKI)临床表现多样，并伴有突发性肾功能障碍。近20％的AKI住院患者显示资源利用率增加和预后不良。AKI和慢性肾脏疾病(CKD)是相互关联的。AKI的持续病理变化导致CKD的发展，CKD打破了肾小管周毛细血管、肾小管细胞和间质细胞之间的微环境平衡，其最明显的特征之一是细胞外基质的沉积和纤维化的形成。尽管存在透析、保守治疗和肾移植等治疗方式，肾脏疾病仍然对人们的健康构成重大威胁。肾脏疾病的治疗具有很大困难，迄今为止，大多数肾脏疾病都无法治愈。因此，探索更有效的治疗方法仍然是治疗肾脏疾病的重大挑战。
[0003]间充质干细胞(MSCs)具有自我更新和多向分化能力。MSCs可以从多种来源获得，包括骨髓，脂肪组织，羊膜，绒毛膜和脐带。其中，人脐带间充质干细胞(hucMSCs)具有较强的增殖能力、较低的免疫原性、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等优势。研究发现，hucMSCs在糖尿病肾病、骨关节炎、肝硬化、心脏病等具有一定的疗效。然而，MSCs的长期安全性、储存和运输困难等问题限制了其临床应用。因此，迫切需要寻找干细胞衍生物进行替代治疗。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物及其制备方法和应用。本专利技术通过梯度挤压方式制备所得的hucMSC
‑
EVM能够缓解肾组织凋亡，促进增殖；以及减少胶原纤维的生成，本专利技术为hucMSC
‑
EVM治疗急慢性肾损伤提供了新的策略。
[0005]本专利技术提供了一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物的制备方法，包括以下步骤：
[0006]将人脐带间充质干细胞来源的细胞膜进行反复梯度挤压，得到人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物。
[0007]优选的是，所述梯度挤压包括：将人脐带间充质干细胞来源的细胞膜依次通过1μm、400nm、200nm、100nm孔径的脂质体挤出膜。
[0008]优选的是，所述脂质体挤出膜包括聚碳酸酯膜。
[0009]优选的是，所述反复梯度挤压的次数≥20次。
[0010]优选的是，所述人脐带间充质干细胞来源的细胞膜的提取方法包括以下步骤：
[0011]将人脐带间充质干细胞进行原代培养、传代培养，得到传代至P3～P6代的人脐带
间充质干细胞，消化，第一离心，得到细胞沉淀；
[0012]将所述细胞沉淀与蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合，裂解，第二离心，得到人脐带间充质干细胞来源的细胞膜。
[0013]优选的是，所述裂解的条件包括冻融2～3次后，超声处理2min，所述超声处理为每超声10s冰上放置10s。
[0014]优选的是，所述第二离心包括：在4℃，800g离心10min，得到第一上清；将所述第一上清在4℃，10000g离心30min，得到第二上清；将所述第二上清在4℃，100000g离心2h。
[0015]优选的是，所述第二离心后还包括：将所述第二离心得到的细胞沉淀洗涤，重悬，在4℃下放置12h。
[0016]本专利技术还提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物。
[0017]本专利技术还提供了上述技术方案所述人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物在制备具有以下
①
～
⑤
所述任意一种作用的药物中的应用：
[0018]①
治疗和/或缓解急性和/或慢性肾损伤；
[0019]②
治疗肾纤维化；
[0020]③
促进肾组织细胞增殖；
[0021]④
减少胶原纤维的生成；
[0022]⑤
抑制肾小管上皮细胞凋亡。
[0023]本专利技术提供了一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物的制备方法。本专利技术对人脐带间充质干细胞来源的细胞膜梯度挤压，获得hucMSC
‑
EVM。体外试验结果表明，hucMSC
‑
EVM体外能够抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡，以及转化生长因子
‑
β(TGF
‑
β)引起的纤维化样改变。体内用于急慢性肾损伤小鼠模型治疗后发现更能够缓解肾脏损伤，具体的，本专利技术提供的hucMSC
‑
EVM在顺铂诱导的急性肾损伤模型中，能够缓解肾组织凋亡，促进增殖；在单侧输尿管结扎诱导的慢性肾损伤模型中，能够减少胶原纤维的生成，本专利技术为治疗急慢性肾损伤提供了新的策略。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]图1为本专利技术提供的人脐带间质干细胞(hucMSCs)的分离培养与鉴定结果图；其中，A为hucMSCs原代与传代培养图，B为hucMSCs成脂与成骨鉴定图，C为hucMSCs表面标记鉴定图；
[0026]图2为本专利技术提供的制备人脐带间质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物(hucMSC
‑
EVM)流程图；
[0027]图3为本专利技术提供的挤压次数过少，hucMSC
‑
EVM粒径分布图；
[0028]图4为本专利技术提供的hucMSC
‑
EVM的表征与鉴定结果图；其中，A为hucMSC
‑
EVM粒径分布图，B为hucMSC
‑
EVM透射电镜图，C为hucMSC
‑
EVM蛋白鉴定图，D为hucMSC
‑
EVM原子力显
微镜图，E为hucMSC
‑
EVM考马斯亮蓝染色图；
[0029]图5为本专利技术提供的hucMSC
‑
EVM体外抑制顺铂诱导的HK2细胞凋亡及氧化应激结果图；其中，A为HK2细胞经不同处理后qRT
‑
PCR结果图，B为HK2细胞经不同处理后Westernblot结果图，C为HK2细胞经不同处理后流式检测细胞凋亡结果图，D为HK2细胞经不同处理后活性氧检测结果图；
[0030]图6为本专利技术提供的hucMSC
‑
EVM体内缓解顺铂诱导的急性肾损伤，促进肾组织增殖结果图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将人脐带间充质干细胞来源的细胞膜进行反复梯度挤压，得到人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡模拟物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述梯度挤压包括：将人脐带间充质干细胞来源的细胞膜依次通过1μm、400nm、200nm、100nm孔径的脂质体挤出膜。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述脂质体挤出膜包括聚碳酸酯膜。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反复梯度挤压的次数≥20次。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞来源的细胞膜的提取方法包括以下步骤：将人脐带间充质干细胞进行原代培养、传代培养，得到传代至P3～P6代的人脐带间充质干细胞，消化，第一离心，得到细胞沉淀；将所述细胞沉淀与蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合，裂解，第二离心，得到人脐带间充质干细胞来源的细胞膜。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述裂解的条件包括冻融2～3次后，超声处理2min，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱晖，金灿，许文荣，纪成，孙梓暄，史惠，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：