一种用于细胞肉的可食性微载体及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于细胞肉的可食性微载体及其制备方法。包括以下步骤：制备油包水型乳化剂溶液；制备壳聚糖溶液；壳聚糖微球的形成以及相分离；收集样品与去除杂质。本发明专利技术利用反相包埋法二次乳化程序构建了大体系细胞3D培养微载体的制备方法，该方法简便、高效，可以根据实际需求调节制备体系并可以兼顾制备整体柱及凝胶颗粒，具有广阔的市场前景。有广阔的市场前景。有广阔的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
一种用于细胞肉的可食性微载体及其制备方法

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[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种用于细胞肉的可食性微载体及其制备方法。

技术介绍
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[0002]动物肉作为一种不可或缺的食物蛋白来源，在全球的餐桌上占据了相当大一部分的比例。全球人类对动物蛋白或动物肉日益增长的需求对传统畜牧业甚至是全球生态均是极大的挑战。对于此，全世界的相关领域均开始致力于开展替代肉的相关研究，植物性肉类提供的蛋白质替代品经历了快速增长和市场需求，但大多数消费者仍然想吃真正的肉制品。细胞肉是肌肉干细胞通过生物反应器扩增来获得的可食用动物肌肉组织，其口感与动物肉制品基本无差异，具有广阔的市场前景。
[0003]在细胞肉的培养过程中，支架扮演重要的作用，它为细胞提供了黏附、增殖和分化的空间，是细胞获取营养物质、气体交换、排泄废物和生长代谢的主要场所，有利于细胞外基质的形成。在细胞肉中，支架除了满足良好的生物相容性、易加工成型、适宜的结构等基本要求外，作为一种食品，其还应满足食品材料要求。在各种支架类型中，微载体是最好的候选材料之一，它比表面积高，可以模拟细胞外基质，能够有效利用培养空间和培养基。其本身也可以通过模拟动物细胞外基质，使其具有动物肉的口感。因此开发新型微载体支架对细胞肉具有重要意义。
[0004]壳聚糖是一种线性多糖，它广泛存在于植物、昆虫以及贝壳等甲壳类动物中。众所周知，壳聚糖的年产量仅次于纤维素，产量位居第二。基于壳聚糖的细胞支架因其具有生物相容性、生物可降解性和抗菌性而被广泛用于医疗领域。这是因为它的骨架与糖胺聚糖相似，是骨骼细胞外基质的组成部分。这种结构有利于细胞的附着和增殖。壳聚糖可以作为细胞肉支架的主要原料，这是因为它来源广泛、成本低、生物相容性好。
[0005]但壳聚糖微载体的制备过程在往往需要化学交联剂，而化学交联剂在食品中被禁止使用，因此，寻找合适的可食性壳聚糖制备方法使其应用于细胞肉生产的关键问题。

技术实现思路
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[0006]本专利技术要解决的技术问题是壳聚糖微载体的制备过程在往往需要化学交联剂，而化学交联剂在食品中被禁止使用，需要寻找合适的可食性壳聚糖制备方法。
[0007]为解决上述问题，本专利技术利用天然酸性聚合物溶液取代传统的相转变液，得到离子交联的壳聚糖微球，辅助后续的净化方法，最终得到用于细胞肉的可食性微载体。
[0008]为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现，一种用于细胞肉的可食性微载体的制备方法，包括以下步骤：
[0009](1)制备油包水型乳化剂溶液：将油包水型乳化剂混合到油相溶剂中，高速搅拌至充分溶解；以油相试剂构建反向包埋方法，通过添加Span80、Span85等实现其乳化功能，用于后期分散水溶性样品后形成乳浊液颗粒状物质；其中乳化剂的添加是影响其粒径的因素
之一，乳化剂可以促进水溶性溶液样品与油相(液体石蜡、正己烷等)的结合，高浓度乳化剂会提高混合速率及混合效果，导致产生较小的乳液，最终形成较小的载体颗粒。
[0010](2)制备壳聚糖溶液：将壳聚糖按照1:25～1：100的料液比(g：ml)加入1％～3％的溶剂中，加热溶解至澄清透明；
[0011](3)壳聚糖微球的形成以及相分离：将步骤(2)的壳聚糖溶液以1:5～1:50的比例加入到步骤(1)的乳化剂溶液中以200
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400rpm条件下初步乳化成乳浊液；将体系缓慢降温至
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5～
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30℃体系稳定0.5h
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5h；在上述乳化体系中加入合成或天然酸性聚合物溶液；持续搅拌2h
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10h得到离子交联的壳聚糖微球；可添加的天然酸性聚合物例如大豆分离蛋白，卵清蛋白，明胶，胶原蛋白，乳清分离蛋白，透明质酸，硫酸软骨素，海藻酸钠溶液；合成酸性聚合物溶液例如三偏磷酸钠，聚乳酸，这些聚合物在一定的条件下(例如pH6
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8)带负电荷，而此时壳聚糖带正电荷，因此，两者可由离子相互作用交联。
[0012](4)收集样品与去除杂质：搅拌结束后将乳化体系静置1分钟后倒出，然后将壳聚糖微载体倒入200目筛网中使用大量的水冲洗，移除体系中的连续相(液体石蜡、正己烷等有机相)，得到含壳聚糖微球的分散相；将样品(即指含壳聚糖微球的分散相)用可食用乙醇、丙酮、去离子水中的一种或几种混合进行洗涤，去除残余的氢氧化钠、壳聚糖溶剂和表面活性剂，得到高纯度壳聚糖微载体，并进一步降低细胞毒性。
[0013]进一步的，步骤(1)所述油包水型乳化剂溶液的乳化剂为Span80和/或Span85，油相溶剂为正己烷、环己烷、液体石蜡、食用油中的一种或一种以上混合物。
[0014]进一步的，步骤(2)在30
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70℃条件下加热溶解。
[0015]进一步的，步骤(2)为溶解壳聚糖的溶剂为纯水、乙酸、磷酸盐缓冲液中的一种或一种以上混合物。
[0016]进一步的，步骤(3)所述合成或天然酸性聚合物溶液为三聚磷酸钠溶液、海藻酸钠溶液、鱼精蛋白溶液、胶原溶液、明胶细菌纤维素溶液、大豆分离蛋白溶液中的一种或几种的混合物。
[0017]进一步的，步骤(4)将筛分完毕的高纯度壳聚糖微载体分散在20％乙醇中，并于室温下搅拌2h，随后微载体用去离子水充分冲洗去除残留杂质。
[0018]进一步的，所述制备方法还包括壳聚糖微载体的净化方法，包括以下步骤：
[0019](5
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1)将步骤(4)制备的壳聚糖微载体依次用80％，60％，40％，20％的乙醇水溶液分散后机械搅拌30min，随后超声12min；上述净化过程重复4遍；最后用灭菌水配置75％乙醇水溶液密封保存；梯度乙醇结合超声清洗用于去除3D微载体空隙中残留的有机试剂，降低细胞毒性；同时兼具杀灭细菌等功能。
[0020](5
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2)梯度净化3D微载体用无菌水冲洗5遍，随后无菌条件下冻干保存；净化后样品冻干保存可以有效提升产品质量和保质期。
[0021](5
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3)梯度净化样品用无菌水冲洗5遍，冷冻干燥，121℃高压灭菌处理保存。壳聚糖颗粒耐受高温高压，可以采用高温高压灭菌的方法去除壳聚糖残留细菌等杂质，更有利于后期细胞培养。
[0022]一种上述方法制备的可食性壳聚糖冷冻凝胶细胞3D培养微载体，相比于传统凝胶颗粒制备局限于小体系，该方法可以通过等比例放大制备大体系凝胶样品，通过调整转速，反应温度，反应时间可以将凝胶批次制备体积提升到10L以上。其中，转速的增加/降低会增
加/降低乳化体系的剪切力，进而降低/增加使壳聚糖微载体的粒径，对于小体系(例如500mL
‑
1000mL)向大体系(10L以上)过度时，体系中保持一定的剪切力可使壳聚糖微载体的粒径保持在一定范围内。体系温度与反应时间是调节壳聚糖微载体孔隙的关键因素，对于小体系(例如500mL
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1000mL)向大体系(10L以上)过度时，需要通过调节反本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于细胞肉的可食性微载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)制备油包水型乳化剂溶液：将油包水型乳化剂混合到油相溶剂中，高速搅拌至充分溶解；(2)制备壳聚糖溶液：将壳聚糖按照1:25～1：100的料液比加入1％～3％的溶剂中，加热溶解至澄清透明；(3)壳聚糖微球的形成以及相分离：将步骤(2)的壳聚糖溶液以1:5～1:50的比例加入到步骤(1)的乳化剂溶液中以200
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400rpm条件下初步乳化成乳浊液；将体系缓慢降温至
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5～
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30℃体系稳定0.5h
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5h；在上述乳化体系中加入合成或天然酸性聚合物溶液；持续搅拌2h
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10h得到离子交联的壳聚糖微球；(4)收集样品与去除杂质：搅拌结束后将乳化体系静置1分钟后倒出，然后将壳聚糖微载体倒入200目筛网中使用大量的水冲洗，移除体系中的连续相，得到含壳聚糖微球的分散相；将上述含壳聚糖微球的分散相进行洗涤，去除残余的氢氧化钠、壳聚糖溶剂和表面活性剂，得到高纯度壳聚糖微载体。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述油包水型乳化剂溶液的乳化剂为Span80和/或Span85，油相溶剂为正己烷、环己烷、液体石蜡、食用油中的一种或一种以上混合物。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)在30
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【专利技术属性】
技术研发人员：郑洪伟，薛长湖，周旋，王长云，
申请(专利权)人：青岛海洋食品营养与健康创新研究院，
类型：发明
国别省市：