一种三文鱼肌肉卫星细胞提取方法技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种三文鱼肌肉卫星细胞提取方法。包括以下步骤：(1)三文鱼肌肉组织；(2)PBS清洗肌肉组织，用剪刀将肌肉组织剪为小块；(3)将碎肌肉组织转移至含有抗生素和胶原蛋白酶Ⅰ的L

【技术实现步骤摘要】
一种三文鱼肌肉卫星细胞提取方法

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[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种三文鱼肌肉卫星细胞提取方法。

技术介绍
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[0002]随着社会经济的飞速发展，近年来肉类农产品出现供不应求的现象。传统畜牧业资源消耗多，环境污染严重，还存在动物福利与动物疫病等问题，矛盾日益突出，亟需发展绿色的肉类生产技术。细胞培养肉是近年来兴起的一项具有颠覆性的肉类生产技术，旨在利用干细胞和组织工程在不牺牲动物的情况下生产农副产品。生产细胞培养肉首先需要获得肌肉卫星细胞、脂肪干细胞、间充质干细胞等“种子”细胞，其中应用最多的是肌肉卫星细胞，它们是肌肉的主要成体干细胞。
[0003]肌肉卫星细胞又称为肌肉干细胞，是位于肌肉组织基膜和肌细胞膜之间的一类单核干细胞，一般处于静息状态。当受到刺激或损伤时会被激活，通过增殖、分化为成肌细胞。一部分可以与其他成肌细胞融合为新的多细胞核肌管，从而形成肌纤维；另一部分自我更新补充干细胞，以保持自身数量稳定。肌肉卫星细胞经过分离提取可以实现体外培养，进行增殖、分化形成肌肉组织。近年来，猪、牛、鸡等动物肌肉卫星细胞的提取及培养有了系统的发展，由于物种的差异性以及技术不相通性，对于海水鱼尤其是三文鱼肌肉卫星细胞的提取分离并没有很好的分离方法。
[0004]三文鱼被誉为“鱼中至尊”、“水中珍品”，其肉质鲜美，口感颇佳，富含Omega
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3不饱和脂肪酸等营养成分，是世界上最有益健康的鱼类之一。目前市场上三文鱼供不应求，价格维持在较高水平。三文鱼肌肉卫星细胞可作为细胞培养肉的“种子”细胞，因而其提取及分离方法也是三文鱼细胞培养肉发展过程中重要的部分之一。因此，开发一种高效的、稳定的三文鱼肌肉卫星细胞提取方法具有重要的意义，而目前肌肉提取液以及传统的培养基无法实现微型细胞的生长，限制了三文鱼肌肉卫星细胞提取以及进一步的分离培养。

技术实现思路
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[0005]本专利技术要解决的技术问题是开发一种高效的、稳定的三文鱼肌肉卫星细胞提取方法具有重要的意义，而目前肌肉提取液以及传统的培养基无法实现微型细胞的生长，限制了三文鱼肌肉卫星细胞提取以及进一步的分离培养。
[0006]为解决上述问题，本专利技术通过调整细胞培养基，并优化增殖温度，实现了三文鱼肌肉卫星细胞提取以及分离培养，为进一步的得到三文鱼细胞培养肉奠定了基础。
[0007]为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现，一种三文鱼肌肉卫星细胞提取方法，包括以下步骤：
[0008](1)选取三文鱼鱼苗，处死，在无菌环境下解剖，获得三文鱼肌肉组织，置于含抗生素的L
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15基础培养基中暂存；
[0009](2)PBS清洗肌肉组织，用剪刀将肌肉组织剪为小块；
[0010](3)将碎肌肉组织转移至含有抗生素和胶原蛋白酶Ⅰ的L
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15基础培养基中，室温消
化；
[0011](4)将消化液离心；
[0012](5)将离心后的沉淀加入L
‑
15完全培养基中，吹打重悬，离心；
[0013](6)将沉淀重悬接种于6孔板中，在15℃～28℃温度范围内培养，该温度范围内三文鱼肌肉卫星细胞均可以存活并增殖，其中28℃的细胞长势更好。
[0014]进一步的，步骤(3)中胶原蛋白酶Ⅰ的添加量为0.33mg/mL～0.5mg/mL；消化时间为30min～45min。胶原酶通过水解细胞间质的脯氨酸，从而使细胞离散，但酶浓度过高、消化时间过长会对细胞活力产生损伤；较低浓度的酶又难以有效解离释放细胞。此外，由于酶价格较高，适当降低酶的浓度，延长消化时间还可以节约成本。
[0015]进一步的，步骤(4)、(5)中离心的参数为300g离心5min。动物细胞离心速率一般为300g，此离心力下可有效的分离细胞与杂质，而转速过高、离心时间过长将造成细胞损伤，较低的转速难以实现细胞与杂质的分离。
[0016]进一步的，步骤(4)将消化液过40μm筛网后离心。可用于细胞分散以及初步的杂质分离，去除杂质可以实现细胞的高效率均一分布，通过筛网分散可以实现细胞的单分散特征。
[0017]进一步的，步骤(5)所述L
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15完全培养基含10％胎牛血清、1％青霉素
‑
链霉素、2.5μg/mL两性霉素B、2ng/mLFGF
‑
2、20mMHEPES。胎牛血清含有丰富的细胞生长必需的营养成分，可促进细胞增殖；青霉素
‑
链霉素、两性霉素两种抗生素可抑制细菌及真菌增殖；FGF
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2作为细胞生长因子促进细胞增殖；HEPES可以缓冲培养基pH。
[0018]进一步的，步骤(5)所述L
‑
15完全培养基含10％胎牛血清、1％青霉素
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链霉素、2.5μg/mL两性霉素B、10ng/mLFGF
‑
2、10ng/mLEGF、20mMHEPES。EGF可促进细胞分裂和生长，促进细胞吸收营养物质。
[0019]进一步的，步骤(5)离心后还包括以下步骤(5
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2)：离心后，在沉淀中加入胰酶，室温消化，加入完全培养基终止消化，合并两次消化液，过筛网，离心；离心后沉淀用L
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15完全培养基重悬，离心，重复两次。进一步利用胰酶消化细胞外基质，释放出更多的肌肉干细胞。
[0020]进一步的，步骤(5
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2)中离心的参数为300g离心5min；胰酶添加量为0.1％～0.25％；消化时间为5min～10min。利用胰酶进一步消化，去除细胞表面细胞外基质，获得更多的单细胞。由于胰酶消化能力较强，且对细胞活力影响较大，需要对酶添加量及消化时间进行控制。
[0021]本专利技术的有益效果在于：通过提取步骤及培养基组成成分优化，简化三文鱼肌肉干细胞提取步骤，实现三文鱼肌肉干细胞的高效增殖，为后续三文鱼细胞培养肉的制备提供“种子”干细胞。
附图说明
[0022]图1：实施例1细胞培养48h细胞生长状况。
[0023]图2：实施例2细胞培养48h细胞生长状况。
[0024]图3：实施例3A15℃、B28℃细胞培养48h细胞生长状况。
[0025]图4：实施例4细胞培养48h细胞生长状况。
[0026]图5：实施例3中细胞传代培养(28℃)。
[0027]图6：对比实施例1中细胞培养48h细胞生长状况。
[0028]图7：对比实施例2中细胞培养48h细胞生长状况。
具体实施方式：
[0029]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0030]实施例1：
[0031本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三文鱼肌肉卫星细胞提取方法，其特征在于包括以下步骤：(1)选取三文鱼鱼苗，处死，在无菌环境下解剖，获得三文鱼肌肉组织，置于含抗生素的L
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15基础培养基中暂存；(2)PBS清洗肌肉组织，用剪刀将肌肉组织剪为小块；(3)将碎肌肉组织转移至含有抗生素和胶原蛋白酶Ⅰ的L
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15基础培养基中，室温消化；(4)将消化液离心；(5)将离心后的沉淀加入L
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15完全培养基中，吹打重悬，离心；(6)将沉淀重悬接种于6孔板中，在15℃～28℃条件下培养。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中胶原蛋白酶Ⅰ的添加量为0.33mg/mL～0.5mg/mL；消化时间为30min～45min。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)、(5)中离心的参数为300g离心5min。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)将消化液过40μm筛网后离心。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)所述L
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15完全培...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑洪伟，薛长湖，魏迎新，许维娜，
申请(专利权)人：青岛海洋食品营养与健康创新研究院，
类型：发明
国别省市：