一种鳜鱼脊髓组织细胞系-37及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种鳜鱼脊髓组织细胞系

【技术实现步骤摘要】
一种鳜鱼脊髓组织细胞系
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37及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及水生生物细胞及水产养殖病害防控
，具体涉及一种鳜鱼脊髓组织细胞系
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37及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]鳜鱼（Mandarin fish，Siniperca chuatsi）是我国特有的淡水鱼类，属于鲈形目、暖鲈科、鳜亚科，营养价值高、肉质鲜美，在我国广泛分布，深受消费者喜爱。总养殖产量达到32万吨，产值超过200亿元人民币。各种环境应激因素，包括高温、缺氧和病害，经常损害鱼类健康，给水产养殖业造成严重的经济损失。鳜鱼养殖主要病害有细菌性疾病、寄生虫病和病毒性疾病，以病毒性疾病危害最为严重，主要有传染性脾肾坏死病毒（ISKNV），蛙虹彩病毒（SCRaV），弹状病毒（SCRV）。ISKNV是导致鱼类高死亡率的病毒之一，如鳜鱼、鲈鱼和墨瑞鳕等造成重大的经济损失。感染ISKNV的鱼表现为体色变黑、腹部肿胀、鱼鳃苍白、脾脏肿大。但是，在一些鱼类中报道了亚临床病毒感染，使得对该病的防控变得很艰难。SCRaV是鳜鱼养殖业新发现的病原体，近年来较为普遍，具有较高的发病率。最早报道的MRV
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GD1301分离株是在2013年从大型杂交鳜鱼中分离出来的一种类似于大口黑鲈虹彩病毒（LMBV）特征的新型致死性病毒，感染SCRaV的鱼表现为嗜睡、厌食和腹部肿胀且部分有腹水，对于该病，在自然条件下的持续感染将是防控的难点。SCRV有很强的致病性，感染的鱼表现为体表、鳍和部分内脏器官出血，致死率高达80%
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100%。有相关报道表明，正常生长的成年鳜鱼也可以携带传染性的SCRV，这些携带病毒且没有明显临床症状的活成鱼，给该病的防控带来了巨大的挑战。三种病毒具有传染性强、致死率高，给鳜鱼养殖业造成了重大的经济损失，严重威胁该产业的健康发展。因此，这些病毒性疾病的防治已成为当今鳜鱼养殖业急需解决的重要问题。
[0003]连续稳定的细胞系是进行体外研究病毒分离、鉴定、发病机制和基于细胞培养的病毒疫苗的必备工具。同源细胞系，尤其是来自于同一物种，被视为应对未知病毒暴发的宝贵的工具。自1962年，Wolf等建立第一个鱼类细胞系：虹鳟性腺细胞系RTG
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2。截至目前，已有864个鱼类细胞系。此前，国内已经建立了鳜鱼苗细胞系（MFF
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1）、鳜全脑细胞系（CPB）、鳜胚胎细胞系（MFE）和鳜脊髓组织细胞系（SCC），主要在24
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28℃培养，生长速度慢，均使用胎牛血清，使得成本较高。因此，有必要驯化鳜脊髓组织细胞系，建立一种生长快，成本低的且对三种病毒同时敏感的鳜鱼脊髓组织细胞系。
[0004]本研究中，利用本实验室已建立的只能在24
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28℃生长的SCC，通过优化细胞培养工艺包括培养温度和血清浓度，驯化建立能在37℃生长的鳜鱼脊髓组织细胞系
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37（SCC
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37），且细胞的生长速度加快，培养成本降低。并分析了该细胞系的特性，进行了对几种鳜鱼常见病毒的敏感性。为大规模生产缩短了细胞培养周期，提高生产效率，为研发安全、高效和价廉的疫苗奠定基础。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有鳜鱼细胞系生长速度慢、培养成本高以及无法对多种病毒同时敏感的问题，提供了一种鳜鱼脊髓组织细胞系
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37及其构建方法与应用。该鳜鱼脊髓组织细胞系
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37的构建方法以鳜鱼脊髓组织细胞系为对象，成功在37℃驯化培养。鳜鱼脊髓组织细胞
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37对多种病毒敏感，可为分离、鉴定鱼类病毒提供重要的工具，为研发安全、高效和价廉的病毒疫苗奠定基础。同时，本专利技术驯化的方法也可以应用于其它鱼类细胞在不同温度的驯化。本专利技术的技术方案为：第一方面，本专利技术提供一种鳜鱼脊髓组织细胞系
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37，于2022年12月9日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国，武汉，武汉大学），保藏编号为 CCTCC NO：C2022352，命名为：鳜鱼脊髓组织细胞系
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37。
[0006]进一步地，所述鳜鱼脊髓组织细胞系
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37是通过鳜鱼脊髓组织细胞驯化构建。
[0007]第二方面，本专利技术提供一种鳜鱼脊髓组织细胞系
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37的构建方法，包括以下步骤：步骤1，鳜鱼脊髓组织细胞的传代：将鳜鱼脊髓组织细胞使用1号培养液进行传代培养；优选地是，置于28
±
1℃恒温培养箱中传代培养至稳定生长状态；步骤2，第一驯化培养：取步骤1获得的稳定生长状态细胞经胰蛋白酶
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EDTA消化液消化后使用2号培养液进行第一传代培养；优选地是，置于37℃恒温培养箱中传代培养至稳定生长状态；步骤3，第二驯化培养：将步骤2获得的稳定生长状态的细胞经胰蛋白酶
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EDTA消化液消化后使用3号培养液进行第二传代培养；优选地是，置于37℃恒温培养箱中传代培养至稳定生长状态；步骤4，第三驯化培养：将步骤3获得的稳定生长状态的细胞经胰蛋白酶
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EDTA消化液消化后使用4号培养液进行第三传代培养；优选地是，置于37℃恒温培养箱中传代培养至稳定生长状态。
[0008]所述步骤1中，优选地，每3
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4天传一代；优选地，所述1号培养液为含有100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20％胎牛血清的L
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15培养液。
[0009]所述步骤2中，优选地，每10
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15天传一代；优选地，所述2号培养液为含有100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10％胎牛血清的L
‑
15培养液。
[0010]所述步骤3中，优选地，每8
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9天传一代；优选地，所述3号培养液为含有100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20％新生牛血清的L
‑
15培养液。
[0011]所述步骤4中，优选地，每5
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6天传一代；优选地，所述4号培养液为含有100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10％新生牛血清的L
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15培养液。
[0012]本专利技术还公开了鳜鱼脊髓组织细胞系
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37在蛙虹彩病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、弹状病毒分离、培养、检测以及疫苗制备中的应用。
[0013]与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1）本专利技术通过对鳜鱼脊髓组织细胞进行驯化及传代培养，建立了鳜鱼脊髓组织细胞系
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37，该细胞系
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37可以稳定培养，连续传代，目前已传至30代。
[0014]2）本专利技术获得的鳜鱼脊髓组织细胞系
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37可连续稳定传代，因此可以大规模生产鳜鱼脊髓组织细胞，且所用血清价廉，传代后有较好的生长状态，可进行冻存与复苏。
[0015]3）本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鳜鱼脊髓组织细胞系
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37，其特征在于，于2022年12月9日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO：C2022352，命名为：鳜鱼脊髓组织细胞系
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37。2.根据权利要求1所述的鳜鱼脊髓组织细胞系
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37，其特征在于，所述鳜鱼脊髓组织细胞系
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37是通过鳜鱼脊髓组织细胞驯化构建。3.一种鳜鱼脊髓组织细胞系
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37的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，鳜鱼脊髓组织细胞的传代：将鳜鱼脊髓组织细胞使用1号培养液进行传代培养；优选地是，置于28
±
1℃恒温培养箱中传代培养至稳定生长状态；步骤2，第一驯化培养：取步骤1获得的稳定生长状态细胞经胰蛋白酶
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EDTA消化液消化后使用2号培养液进行第一传代培养；优选地是，置于37℃恒温培养箱中传代培养至稳定生长状态；步骤3，第二驯化培养：将步骤2获得的稳定生长状态的细胞经胰蛋白酶
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EDTA消化液消化后使用3号培养液进行第二传代培养；优选地是，置于37℃恒温培养箱中传代培养至稳定生长状态；步骤4，第三驯化培养：将步骤3获得的稳定生长状态的细胞经胰蛋白酶
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EDTA消化液消化后使用4号培养液进行第三传代培养；优选地是，置于37℃恒温培养箱中传代培养至稳定生长状态。4.根据权利要求3所述的鳜鱼脊髓组织细胞系
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【专利技术属性】
技术研发人员：姚嘉赟，巩金鹏，潘晓艺，赵颖，蔺凌云，刘忆瀚，沈锦玉，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：