【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种干细胞增殖用无血清培养基及其应用。
技术介绍
0、
技术介绍
：
1、细胞培养肉是一种基于组织工程和肌肉发生且无需对动物进行屠宰的创新理念。区别于植物肉和微生物制成的发酵肉，细胞培养肉富含更多的优质蛋白并且具有更贴近于传统肉制品的食用体验。细胞培养肉具有巨大的开发前景但同时也伴随着更大的技术挑战。其中，最大的难点莫过于降低细胞培养肉生产的成本，尤其是降低细胞体外培养的成本。
2、传统的细胞体外培养是在基础培养基(如dmem、l-15培养基)的基础上添加一定量的动物血清(通常为胎牛血清)。作为应用最广泛的的营养补充剂，胎牛血清虽然能够为细胞生长增殖提供生长因子、激素、氨基酸、蛋白质和维生素等营养物质，但也有不可忽略的缺陷。首先就是胎牛血清价格昂贵，难以应用于大规模生产，并且由于生长环境不同，胎牛血清在不同批次之间存在差异，影响细胞培养肉品质的稳定性。其次，由于胎牛血清是通过屠宰怀孕期间的母牛而获取的，这让胎牛血清的使用存在一些伦理问题。除此之外，胎牛血清还存在被支原体和朊病毒污染的风险，给细胞培养肉的食品安全带来不小的挑战。因此，找到能够替代血清的添加剂，对于细胞培养肉的研发尤为重要。为解决上述问题，无血清培养基被陆续研发出来。无血清培养基是指用激素、生长因子、氨基酸、蛋白质、维生素、碳水化合物、脂类等成分明确的物质代替成分复杂的血清添加到培养基中，进而满足细胞正常生长。目前无血清培养基已实现商品化，但由于不同类型的细胞所需要的营养成分不同，使得无血清培养基表现出细胞特
3、肌肉组织来源于发育过程中的近轴中胚层祖细胞。近轴中胚层通过多种生长因子调控的顺序发育过程分化为成肌细胞。成肌细胞通过细胞融合形成肌肉组织，其中一部分位于肌纤维基底膜下，在出生后转化为静止的肌肉干细胞。在肌肉损伤后，静止的肌肉干细胞被激活，分化为成肌细胞，并促进肌肉再生。自首次以牛肌肉细胞为原料生产出培养肉以来，肌肉干细胞就因其优越的增殖分化性能被广泛用于细胞培养肉的生产。肌肉干细胞的增殖和分化受多种生长因子的影响，如成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,fgf)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,igf)、转化生长因子β(transforming growth factor-β,tgf-β)、血小板衍生生长因子(platelet derivedgrowth factor,pdgf)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,hgf)等。另外，在培养肉的生产过程中，通常也会用到睾酮、生长激素和糖皮质激素这三种鱼生理系统相关的三种关键激素。
4、血浆是血液的液体成分，其主要作用是运载血细胞以及运输维持人体生命活动所需的物质和体内产生的废物。血浆中的血浆蛋白作为一种亲水胶体，可与多种难溶解的营养物质结合，帮助营养物质的运输。此外，血浆蛋白分解产生的氨基酸，也为细胞合成蛋白质以及能量代谢提供原料。除此之外，血浆中也包含生长因子、激素、电解质、营养素、胆固醇和其他重要组分。随着我国畜牧业的迅猛发展，畜产品的副产物也日益增多。血液作为占比最大的副产物，在猪和家禽中得到了较为充分的利用，但牛血因腥味重、适口性差以及难保存等因素，使其未得到充分利用，不仅造成了严重浪费，也给环境造成很大负担。因此，合理开发利用牛血资源具有非常重要的意义。
5、大黄鱼(larimichthys crocea)俗称黄花鱼、黄鱼，属于暖水性集群洄游鱼类，从山东半岛到雷州半岛的海域均有分布。大黄鱼营养丰富，肉质细嫩，具有很高的经济价值，但是由于过度捕捞，使其资源急速衰退。因此，研发大黄鱼细胞培养肉成为解决其资源衰退的有力手段，利用无血清培养基对大黄鱼肌肉干细胞进行培养是一种可行的方向，因此，研究得到一种大黄鱼肌肉干细胞增殖用无血清培养基就成为了重中之重。
技术实现思路
0、
技术实现思路
：
1、本专利技术要解决的技术问题是研发大黄鱼细胞培养肉成为解决其资源衰退的有力手段，但目前未见报道适应于大黄鱼肌肉干细胞增殖用的无血清培养基。
2、为解决上述问题，本专利技术采用多种手段实验后，得到了对牛血浆进行有效处理的方法，使处理后的牛血浆成功替代了胎牛血清，提供了一种让大黄鱼肌肉干细胞快速增殖且显著降低成本的无血清培养基，为之后细胞培养肉的规模化生产提供了一种可行的办法。
3、为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现，一种干细胞增殖用无血清培养基，包括dmem/f12与m199混合培养基、牛血浆提取物、its-g(胰岛素-转铁蛋白-硒)、neaa(非必需氨基酸)、动物源蛋白胨、肌苷、bsa/胆固醇、pvp360000(聚乙烯吡咯烷酮)。
4、与dmem/f12相比，本专利技术中所用的dmem/f12与m199混合培养基，能够补充腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶以及胸腺嘧啶等物质，使培养基的营养成分更全面，有利于细胞进行能量代谢以及物质合成。
5、在预试验中，直接添加牛血浆会导致细胞死亡，推测血浆中存在某些有毒物质，同时为保证无血清培养基的安全性，本研究采用多种手段对牛血浆进行了处理，在处理过程中存在以下问题：(1)h2o2处理后，氧自由基过多；(2)蛋白质、脂质及其他营养物质丢失。血浆中过量的氧自由基会对脂质、蛋白质、糖以及核酸造成破坏，促使细胞死亡。而硒元素能够通过谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧化酶的作用过程降低过氧化物及氧自由基的损伤。另外，胰岛素与转铁蛋白也能够促进细胞对葡萄糖、蛋白质以及微量元素的利用。因此，本专利技术选择添加its-g对硒元素进行补充，在消除残留氧自由基的同时，维持细胞正常的生理生化功能。另外，血浆在经过灭活、过滤后会造成脂质、蛋白质等物质失活、丢失，本专利技术通过添加bsa/胆固醇混合物、neaa和动物源蛋白胨进行弥补。其中，bsa可作为载体，辅助培养基中的营养物质进入细胞，此外bsa还具有抗氧化的功能。胆固醇能够参与形成细胞膜并调节细胞膜的流动性。neaa能够减轻细胞自身合成非必需氨基酸的负担，帮助细胞更好的适应无血清培养基。动物源蛋白胨能够有效地弥补牛血浆提取物中蛋白的损失。除此之外，肌苷与pvp分别起到了促进细胞能量代谢和保护细胞免受机械损伤的作用。经过调整之后的无血清培养基可用于培养大黄鱼肌肉干细胞，实现连续传代。
6、进一步的，所述牛血浆提取物的制备方法包括以下步骤：
7、(1)将含有枸橼酸钠的牛全血离心，收集上清血浆并添加氯化钙溶液，静置；其中，枸橼酸钠的作用是防止牛全血发生凝结；离心的作用是将牛全血中的血细胞和白细胞去除，防止细胞破裂导致细胞内容物外泄；氯化钙的作用是将牛血中的纤维蛋白原去除，培养基或营养补充剂中的钙离子会导致纤维蛋白原转变为纤维蛋白，使加入牛血浆提取物的培养基凝固。
8、(2)静置后再次离心，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种干细胞增殖用无血清培养基，其特征在于：包括DMEM/F12与M199混合培养基、牛血浆提取物、ITS-G、NEAA、动物源蛋白胨、肌苷、BSA/胆固醇、PVP360000。
2.如权利要求1所述的干细胞增殖用无血清培养基，其特征在于所述牛血浆提取物的制备方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的干细胞增殖用无血清培养基，其特征在于：步骤(1)中枸橼酸钠按体积比添加3-10％。
4.如权利要求2所述的干细胞增殖用无血清培养基，其特征在于：步骤(1)牛全血在16-22℃，以1000g/min离心20min，收集上清并按体积比添加5％-15％氯化钙溶液，静置12-48h。
5.如权利要求2所述的干细胞增殖用无血清培养基，其特征在于：步骤(2)静置后以3000-12000r/min离心10-20min，收集上清液并在56-65℃水浴加热0.5-1h；随后按体积比添加5％-15％的H2O2，在室温下涡旋振荡10-30s使其充分混合。
6.如权利要求1所述的干细胞增殖用无血清培养基，其特征在于：所述无血清培养基中以体积比计，
7.如权利要求1或6所述的干细胞增殖用无血清培养基，其特征在于：DMEM/F12与M199按照体积比5:5-8:2进行混合。
8.如权利要求1或6所述的干细胞增殖用无血清培养基，其特征在于：BSA/胆固醇的制备方法包括以下步骤：将BSA溶解到PBS中，配置成配置成50-100mg/ml的BSA母液，同时将胆固醇与无水乙醇按1:50-1:25的比例混合，接着按胆固醇:BSA为1:20-1:15的比例进行混合，4-8℃静置过夜后最终得到BSA/胆固醇混合物。
9.权利要求1所述的干细胞增殖用无血清培养基在驯化大黄鱼肌肉干细胞中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种干细胞增殖用无血清培养基，其特征在于：包括dmem/f12与m199混合培养基、牛血浆提取物、its-g、neaa、动物源蛋白胨、肌苷、bsa/胆固醇、pvp360000。
2.如权利要求1所述的干细胞增殖用无血清培养基，其特征在于所述牛血浆提取物的制备方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的干细胞增殖用无血清培养基，其特征在于：步骤(1)中枸橼酸钠按体积比添加3-10％。
4.如权利要求2所述的干细胞增殖用无血清培养基，其特征在于：步骤(1)牛全血在16-22℃，以1000g/min离心20min，收集上清并按体积比添加5％-15％氯化钙溶液，静置12-48h。
5.如权利要求2所述的干细胞增殖用无血清培养基，其特征在于：步骤(2)静置后以3000-12000r/min离心10-20min，收集上清液并在56-65℃水浴加热0.5-1h；随后按体积比添加5％-15％的h2o2，在室温下涡旋振荡10-30s使其充分混合。
6.如权利要求1所述的干细胞增殖用无血清培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛长湖，郑洪伟，王明昊，殷浩文，魏迎新，周旋，
申请(专利权)人：青岛海洋食品营养与健康创新研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。