牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法及应用。制备方法：取牙髓间充质干细胞，经超速离心后，去除上清液，即得所述牙髓间充质干细胞外泌体。本发明专利技术还提出根据上述方法制得的牙髓间充质干细胞外泌体；该牙髓间充质干细胞外泌体在制备治疗过敏性鼻炎产品中的应用；以及一种用于治疗过敏性鼻炎的药物。本发明专利技术的制备方法能高效制备牙髓间充质干细胞外泌体，制得的外泌体可有效治疗过敏性鼻炎。治疗过敏性鼻炎。治疗过敏性鼻炎。

【技术实现步骤摘要】
牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]变应性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)是一种由特异性IgE介导的Ⅰ型变态反应，主要以阵发性喷嚏、清水涕、鼻塞、鼻痒等鼻过敏症状为特征，严重影响人类的生活质量。据统计，在世界范围内变应性鼻炎总发病率已达25％，部分地区高达40％，世界卫生组织(WTO)将其列为“21世纪重点研究和防治的三大疾病之一”。目前推荐的AR疗法包括：尽量避免接触过敏原、药物治疗和特异性免疫治疗，但后两种治疗方法均有明显的缺陷，不能满足广大患者的需求。其中，药物治疗主要是采用糖皮质激素、抗组胺类药、减充血剂、抗胆碱药和肥大细胞膜稳定剂等药物进行治疗。抗组胺类药对鼻痒、喷嚏、流清涕有较好效果，但对鼻塞效果不明显；减充血剂能有效地缓解鼻粘膜充血，但对其它症状无效；抗胆碱药对缓解流清涕效果好，但对鼻塞、喷嚏症状无效，还有导致鼻腔干涩和出血的副作用；肥大细胞膜稳定剂具有较好的预防过敏性鼻炎的效果，对于已经产生的过敏介质不具有拮抗作用，对过敏性鼻炎的急性发作疗效不佳；糖皮质激素可从多个环节阻断鼻黏膜的过敏性炎症反应，能有效预防和治疗过敏性鼻炎的症状，为目前治疗过敏性鼻炎最有效的一线药物，但其起效缓慢，在用药数日或数周后起效，具有局部刺激的副作用，且糖皮质激素长期局部应用的副作用和远期疗效仍需循证医学的评价。特异性免疫治疗过程繁琐，治疗周期长(往往需3年左右)，见效慢，费用高，且治疗的安全性仍存在不确定性。
[0003]间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是具有自我更新能力的多潜能祖细胞。MSC来源广泛，能够分化为人体内所有主要的细胞，其中骨髓间充质干细胞和牙髓干细胞都属于间充质干细胞，是目前最为广泛的干细胞。大量研究证实MSC对多种疾病具有治疗作用，其中包括变应性鼻炎、结膜炎、哮喘等。但是直接移植具有致瘤、栓塞、异常分化、免疫调节不可控等风险，对其应用造成限制。
[0004]因此，基于间充质干细胞进一步寻找治疗过敏性鼻炎的方法具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法，能够高效地制备牙髓间充质干细胞外泌体。
[0006]本专利技术还提出根据所述制备方法制得的牙髓间充质干细胞外泌体。
[0007]本专利技术还提出所述牙髓间充质干细胞外泌体在制备治疗过敏性鼻炎产品中的应用。
[0008]本专利技术还提出一种用于治疗过敏性鼻炎的药物。
[0009]根据本专利技术的一个方面，提出了牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：取牙髓间充质干细胞，经超速离心后，去除上清液，即得所述牙髓间充质干细胞外泌
体。
[0010]根据本专利技术的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
[0011]本专利技术制备牙髓间充质干细胞来源的外泌体，牙髓间充质干细胞属于成体干细胞，来源广泛(可来源于儿童脱落乳牙、阻生牙、成人智齿、正畸需拔除的牙齿等)，提取方便，所述涉及的伦理问题更少。本专利技术采用超速离心法制备牙髓间充质干细胞外泌体，方法简便，超速离心法可以高效地分离外泌体，由于外泌体与其他细胞器的沉降系数不同，通过高转速的离心可以将其他细胞器及杂蛋白分离出去，只留下外泌体，使用该方法分离的外泌体纯度较高，对治疗多种疾病的效果显著。
[0012]具体地，牙髓间充质干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是一类具有良好增殖、分化能力和免疫调节性能的牙源性间充质干细胞。外泌体是细胞分泌的微小囊泡，通过携带母体细胞特征性生物信息分子(如脂质、蛋白质、DNA、mRNA、miRNA等)，作为细胞间运输载体将这些生物信息分子传递给其他细胞，是细胞间通信的重要介质，并参与维持组织内稳态。牙髓间充质干细胞外泌体(DPSC
‑
exosomes)不仅能够作为仿生物载体运载前体药物进入肿瘤细胞发挥治疗作用，还拥有类似于间充质干细胞的诸多功能，如促进受损组织再生、调节机体免疫功能等。
[0013]在本专利技术的一些实施方式中，所述牙髓间充质干细胞的获取方法包括以下步骤：提取牙齿中的牙髓，清洗后将所述牙髓剪碎形成组织块，对所述组织块进行消化，得牙髓悬液；离心所述牙髓悬液，重悬离心后的细胞沉淀，培养得所述牙髓间充质干细胞。
[0014]具体地，所述牙齿选自脱落乳牙、智齿、多生牙、无治疗价值的牙周炎患牙、正畸需拔除的牙齿中的至少一种。
[0015]具体地，使用含青霉素
‑
链霉素的磷酸盐缓冲液进行所述清洗。
[0016]具体地，所述组织块的体积为0.1～1.0mm3。
[0017]具体地，对所述组织块进行消化使用的消化液为含Ⅰ型胶原酶和中性蛋白酶的培养基。
[0018]具体地，所述离心的转速为1000～1200r/min，时间为5～8min。
[0019]更具体地，所述离心的转速为1000r/min，时间为5min。
[0020]具体地，经所述离心后，去除上清液，留下所述细胞沉淀。
[0021]具体地，重悬离心后的所述细胞沉淀，培养4～8代得所述牙髓间充质干细胞。
[0022]在本专利技术的一些实施方式中，在得到所述牙髓间充质干细胞后，先将所述牙髓间充质干细胞于4～6℃，300～500g条件下离心10～12min，去除未贴壁细胞，收集第一上清液；再将所述第一上清液于4～6℃，1400～1700g条件下离心30～35min，去除死细胞和杂质，收集第二上清液。
[0023]在本专利技术的一些优选的实施方式中，先将所述牙髓间充质干细胞于4℃，300g条件下离心10min，去除未贴壁细胞，收集第一上清液；再将所述第一上清液于4℃，1500g条件下30min，去除死细胞和杂质，收集第二上清液。
[0024]在本专利技术的一些实施方式中，所述制备方法还包括将所述第二上清液于4～6℃，10000～11000g条件下超速离心55～65min，去除细胞碎片，收集第三上清液；再将所述第三上清液于4～6℃，100000～110000g条件下超速离心60～70min，去除上清液，将沉淀重悬即得所述牙髓间充质干细胞外泌体。
[0025]在本专利技术的一些优选的实施方式中，所述制备方法还包括将所述第二上清液于4℃，10000g条件下超速离心60min，去除细胞碎片，收集第三上清液；再将所述第三上清液于4℃，100000g条件下离心60min，去除上清液，将沉淀重悬即得所述牙髓间充质干细胞外泌体。
[0026]在本专利技术的一些实施方式中，在制备好所述牙髓间充质干细胞外泌体后，还需对其进行鉴定，鉴定方法包括：透射电子显微镜观察所述牙髓间充质干细胞外泌体的形态，纳米粒子跟踪分析技术检测所述牙髓间充质干细胞外泌体的粒径，蛋白质印迹分析检测所述牙髓间充质干细胞外泌体标志性蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.牙髓间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取牙髓间充质干细胞，经超速离心后，去除上清液，即得所述牙髓间充质干细胞外泌体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括先将所述牙髓间充质干细胞于4～6℃，300～500g条件下离心10～12min，去除未贴壁细胞，收集第一上清液；再将所述第一上清液于4～6℃，1400～1700g条件下离心30～35min，去除死细胞和杂质，收集第二上清液。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所述第二上清液于4～6℃，10000～11000g条件下超速离心55～65min，去除细胞碎片，收集第三上清液；再将所述第三上清液于4～6℃，100000～110000g条件下超速离心60～70min，去除上清液，将沉淀重悬即得所述牙髓间充质干细胞外泌体。4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘江琦，康成林，郭照萌，刘朋，罗丹丹，赵淼，吴志生，刘志强，曾宪海，
申请(专利权)人：深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院深圳市耳鼻咽喉研究所深圳市龙岗区口腔医学研究所，
类型：发明
国别省市：