一种神经修复蛋白组合物及其制备方法和其应用技术

本发明专利技术涉及一种神经修复蛋白组合物，其制备包括如下步骤：在细胞蛋白提取物中加入20U/mL

【技术实现步骤摘要】
一种神经修复蛋白组合物及其制备方法和其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种神经修复蛋白组合物及其制备方法和其应用。

技术介绍

[0002]细胞是生命活动的基本单位和机体健康的基础。当机体的氧化还原平衡遭到破坏时，会引起氧化还原信号和控制的中断，引发氧化应激损伤而引发多种疾病。脑部缺血缺氧(如脑卒中、脑溢血、长期高原作业、颈内动脉及椎动脉闭塞和/或狭窄等)及氧化应激损伤等，可引发多种因神经元或胶质细胞的丢失而导致的神经退行性疾病，包括记忆力减退、阿尔兹海默症、帕金森症、老年痴呆、多发性硬化症、共济失调、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症等。目前，我国帕金森患者超过300万，渐冻症患者超过20万，老年痴呆患者超过千万，且随着全球人口老年化的加剧而存在高发病率等特点。及时修复损伤细胞可以显著改善、治疗相关病变。
[0003]脑卒中(脑供血动脉狭窄或闭塞导致血液不能流入大脑)及脑溢血(脑部血管突然破裂)为常见的中枢神经系统疾病，因脑供血不足所致脑组织缺血缺氧性损伤，并表现出相应神经功能缺损症状，包括平衡问题、偏瘫、感觉和振动感觉丧失、麻木、反射减弱、上睑下垂、视野缺陷、失语和失用等，过量的自由基是早期急性缺血性卒中缺血再灌注损伤加重的主要原因，该病变具有发病率高、疾病预后差、易复发、致残率高、死亡率高等特点，严重影响人类的健康和生存质量。共济失调多由小脑、本体感觉及前庭功能障碍导致的运动笨拙和不协调，累及躯干、四肢和咽喉肌时可引起身体平衡、姿势、步态及言语障碍，包括小脑性共济失调、大脑性共济失调、感觉性共济失调、前庭性共济失调等，病因复杂且常为多种疾病的综合表现，包括由梗死、水肿或出血导致的急性脑肿胀等。脑外伤多由外物造成的头脑部外伤伤害，常引起不同程度的永久性功能障碍，包括运动、感觉、言语、视觉、听觉等区域异常局灶性症状。周围神经损伤主要由创伤、肿瘤及代谢性疾病(如糖尿病及其并发症)等因素引起的临床常见病，经常会导致机体受累节段运动、感觉和自主功能的部分或全部丧失，甚至出现顽固性神经痛，严重影响患者的生活质量。WHO于2017年发布《全球糖尿病报告》显示，全球糖尿病患病人数呈现逐年增加趋势。我国糖尿病患者1.29亿，其多种并发症(包括周围神经及末梢神经缺血缺氧引起的神经痛、神经损伤等)导致糖尿病患者致残致死等严重后果。
[0004]脑卒中的临床治疗在溶栓的同时强调脑神经保护，以期逆转神经元凋亡并改善神经损伤。丁苯酞可降低细胞内钙离子浓度，抑制谷氨酸释放并减少花生四烯酸生成、清除氧自由基、提高氧化酶活性等，作用于脑缺血病变的多个病理环节，临床将其用于改善脑梗死病灶局部循环，减小梗死面积，减轻脑组织损伤，恢复神经功能，用于急性脑缺血性脑卒中患者神经功能缺损的改善，主要用于治疗轻、中度急性缺血性脑卒中。依达拉奉右莰醇为抗氧化剂和自由基清除剂，可清除多种自由基，减轻脑水肿和组织损伤，抑制脑缺血再灌注导致的炎性因子表达而减少细胞凋亡和细胞坏死，临床将其用于改善急性脑梗塞所致的神经
症状、日常生活活动能力和功能障碍等。
[0005]细胞及微生物受到外界刺激及外源应激物(包括冷、热、酸、碱、电流、辐射、化学物质等)应激诱导时会因应激反应而诱导细胞及微生物产生应激蛋白。文献1(New limonophyllines A
‑
C from the stem of Atalantia monophylla and cytotoxicity against cholangiocarcinoma and HepG2 cell lines，Arch.Pharm.Res.(2018)41:431
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437)公开了从芸香科植物(Atalantia monophylla)提取制得的化合物1
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16具有抑制肿瘤细胞生长等活性。
[0006]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有自我复制和多向分化潜能，广泛存在于骨髓、脂肪、滑膜、牙髓、羊水、胎盘、脐带、胚胎、脐带血、羊膜、外周血、肌肉、尿液等组织，具有来源广泛、无需配型、感染率低、分化潜能强、增殖能力强、采集方便等特点，可产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、白介素
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6(IL
‑
6)、白介素
‑
7(IL
‑
7)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等活性因子，参与调节细胞生长、细胞凋亡、细胞分化、抗病毒、免疫成熟等过程，可用于免疫调节、组织修复及治疗急性肺损伤、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病。但MSCs产品需在其生产、储运和应用等环节采用冷藏方式，且其细胞活力保持≤12h，而限制其治疗应用。为此，需要开发安全有效的神经修复药物以满足临床需求。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种神经修复蛋白组合物，其制备包括下述步骤：
[0008](1)在本专利技术的细胞蛋白提取物中加入20U/mL
‑
35U/mL的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃
±
1℃条件下酶解15min
‑
40min，制得酶解液；
[0009](2)在2℃
‑
8℃条件下，将步骤(1)制得的酶解液用洗脱溶剂配置成5
‑
15mg/ml后，过色谱柱，洗脱流速为0.1
‑
1ml/min，监测并收集紫外波长为280nm的洗脱馏分，即得，其中，洗脱溶剂由50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)中含300mmol/L氯化钠组成。
[0010]本专利技术的优选技术方案中，所述蛋白提取物的制备包括如下步骤：
[0011]S
‑
1:将密度为5.0
×
106个/mL
‑
1.0
×
107个/mL的间充质传代干细胞置于含有DMEM/F12 40
‑
50％、RPMI1640 40
‑
50％、牛血清蛋白(BSA)0.1
‑
2％、表皮细胞生长因子(EGF)1
‑
15ug/mL、成纤维细胞生长因子(FGF)1
‑
15ug/mL、胰岛素转铁蛋白1
‑
15ug/mL、复方氨基酸(18AA)0.01
‑
0.1％和2
‑
10μmol/L应激物的培养基中，再将其置于37.0℃
±
0.5℃、5％
±
1.0％CO2条件下培养2h
‑
6h后，分离，洗涤，收集细胞，其中，所述的应激物选自化合物1
‑
16的任一种或其组合，
[0012][0013][0014]S
‑
2:将收集细胞按照密度为5.0
×
106个/mL
‑
5.0
×
107个/mL分散于溶剂中，再将其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种神经修复蛋白组合物，其制备包括下述步骤：(1)在本发明的细胞蛋白提取物中加入20U/mL
‑
35U/mL的核酸酶或全能核酸酶的任一种或其组合，将其置于37℃
±
1℃条件下酶解15min
‑
40min，制得酶解液；(2)在2℃
‑
8℃条件下，将步骤(1)制得的酶解液用洗脱溶剂配置成5
‑
15mg/ml后，过色谱柱，洗脱流速为0.1
‑
1ml/min，监测并收集紫外波长为280nm的洗脱馏分，即得，其中，洗脱溶剂由50mmo l/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)中含300mmol/L氯化钠组成。2.如权利要求1所述的蛋白组合物，所述蛋白提取物的制备包括如下步骤：S
‑
1:将密度为5.0
×
106个/mL
‑
1.0
×
107个/mL的间充质传代干细胞置于含有DMEM/F12 40
‑
50％、RPMI 1640 40
‑
50％、牛血清蛋白(BSA)0.1
‑
2％、表皮细胞生长因子(EGF)1
‑
15ug/mL、成纤维细胞生长因子(FGF)1
‑
15ug/mL、胰岛素转铁蛋白1
‑
15ug/mL、复方氨基酸(18AA)0.01
‑
0.1％和2
‑
10μmol/L应激物的培养基中，再将其置于37.0℃
±
0.5℃、5％
±
1.0％CO2条件下培养2h
‑
6h后，分离，洗涤，收集细胞，其中，所述的应激物选自化合物1
‑
16的任一种或其组合，
S
‑
2:将收集细胞按照密度为5.0
×
106个/mL
‑
5.0
×
107个/mL分散于溶剂中，再将其置于2℃
‑
8℃条件下超声处理，制得细胞裂解液，其中，所述溶剂选自选自生理盐水、5％葡萄糖溶液、磷酸盐缓冲液(PBS)、TBPS缓冲液、TBST缓冲液、Tr i s缓冲液的任一种或其组合；S
‑
3:将步骤S
‑
2制得的细胞裂解液分离后，所得的分离液依次经...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宇，高文勇，陈琳，李建军，
申请(专利权)人：北京达尔文细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：