一种细胞培养基及其培养NK细胞的方法技术

本发明专利技术公开一种细胞培养基及其培养NK细胞的方法，所述一种细胞培养基，其特征在于，所述培养基为含有体积百分比为10％的灭活血浆，以及500～1500U/mL IL‑2的ALyS505NK‑AC培养基；本发明专利技术用于培养NK细胞的培养基使用灭活血浆，并创造性只使用一种细胞因子(IL‑2)，能够大大降低NK细胞培养中的成本。本发明专利技术培养基用于培养NK细胞，操作步骤更简单，用时短，并能获得数量充足的细胞数量，扩增数量能达到2×10

【技术实现步骤摘要】
一种细胞培养基及其培养NK细胞的方法
本专利技术属于再生医学和生物学
，涉及NK细胞的培养及制剂制备的方法，尤其是一种细胞培养基及其培养NK细胞的方法。
技术介绍
自然杀伤细胞(Naturalkillercells，NKcells)是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，分布于外周各淋巴器官及血液循环系统，无需抗原的预先刺激与活化即可发挥细胞毒效应，并可分泌多种细胞因子及趋化因子，是机体天然免疫的主要承担者，也是获得性细胞免疫的核心调节细胞，在肿瘤免疫、抗病毒感染及清除非己细胞中发挥重要作用。NK细胞过继性免疫治疗是目前临床上肿瘤细胞免疫治疗的重要手段。由于外周血中NK细胞含量少(约占淋巴细胞的5％一10％)，体外扩增高效的NK细胞则成为NK细胞治疗的关键问题之一。许多体外研究均显示IL-2、IL-12、IL-15对促进NK细胞的成熟、活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。但经过研究发现，使用IL-2、IL-12、IL-15等细胞因子的不同组合在一定程度上可以扩增体外的NK细胞，但是外周血样品年龄、是否化疗等条件直接影响了NK细胞的体外扩增成功与否，说明了现有培养体系的稳定性较差。本专利技术对现有技术进行了培养体系的优化改进，仅使用的1-2细胞因子，结合新的培养基，保证各类型血液样品都能扩增成功，年龄段因此我们首先从方法学角度探索提高NK细胞纯度的方法并采用IL-2、IL-12、IL-15等细胞囚子的不同组合，以期提高NK细胞体外扩增的效率及纯度，并进一步从NK细胞穿孔素、颗粒酶BmRNA的表达水平及IFN的分泌水平评价扩增后NK细胞的功能变化，为进一步的临床应用奠定基础。目前NK细胞的培养体系复杂，添加的细胞因子种类繁多，且细胞扩增效果还有待提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述现有技术的不足之处而提供一种培养体系更简单，且能稳定扩增NK细胞，并提高其活性的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种细胞培养基，所述培养基为含有体积百分比为5～20％的灭活血浆，以及500～1500U/mLIL-2的ALyS505NK-AC培养基。体外细胞培养使会加入一定量的血清，一般为胎牛血清，其含有丰富的细胞生长必须的营养成份，对细胞的正常生长具有重要的作用。然后，胎牛血清价格昂贵，且还可能由于处理过程不规范带来污染或者牛源性病毒污染，影响后续的细胞培养。使用灭活血浆价格相对更便宜，且血浆的灭活方法简单，能大大节省成本，并减少污染的发生。另外，一般NK细胞培养需要IL-2和IL-12、IL-15等多种细胞因子，本专利技术培养基仅涉及IL-2一种细胞因子，成本更低，操作更简单。作为本专利技术的优选实施方式，所述培养基中IL-2的浓度为1000U/mL。作为本专利技术的优选实施方式，所述灭活血浆的制备方法为：将血样于2000rpm离心15min，吸取上层血浆至新的离心管中；密封好置于56℃灭活20～50min；2500～3500rpm离心15min，取上层溶液即为所述灭活血浆。本专利技术还要求保护所述培养基在诱导PBMC分化成NK细胞的用途。本专利技术的培养基用于NK细胞的培养所获得的细胞数量充足，细胞活性高。本专利技术还提供了所述培养基用于培养NK细胞的培养方法，包括以下步骤：1)在培养容器中孵育15～20min的Lymactin-NK抗体，然后丢弃Lymactin-NK抗体液2)在步骤1)所述的容器中加入本专利技术所述培养基，并将PBMC接种于所述培养基中，该操作时间计为第0天；3)于第3、5天进行补液，补加含有500～1500U/mLIL-2的ALyS505NK-AC培养基；4)在第7天进行补液，补加含有500～1500U/mLIL-2的ALyS505NK-EX培养基；5)在第9、11天进行补液，补加含有1000U/mLIL-2的ALyS505NK-EX培养基，即得到NK细胞。本方法操作工程简单有效，能显著提高NK细胞的培养成功率；培养过程中，必要时需要将细胞转移至更大的容器中进行培养。作为本专利技术的优选实施方式，所述步骤3)～5)中补加的培养基与步骤2)培养基的体积比为1:1。作为本专利技术的优选实施方式，所述培养基用于培养NK细胞的培养方法的所述步骤2)中，PBMC的接种密度不低于1×106cells/mL。作为本专利技术的优选实施方式，所述培养基用于培养NK细胞的培养方法的所述步骤2)中，所述培养基中使用的灭活血浆与所述PBMC来源于同一供体。使用自体灭活血浆，代替胎牛血清或异源供体灭活血浆，可有效避免牛源性病毒污染或者其他供体中含有的病毒污染。灭活血浆可在制备PBMC的过程获得，更节约成本。作为本专利技术的优选实施方式，所述培养基用于培养NK细胞的培养方法还包括利用ficoll密度梯度离心法分离血样中PBMC的过程。作为本专利技术的优选实施方式，所述用于制备PBMC的血样为外周血。作为本专利技术的优选实施方式，所述ficoll密度梯度离心法分离血样中PBMC的过程如下：1)抽取外周血30mL，2000rpm离心15min；2)吸取离心后的血样的下层血细胞层，并用一次性移液管加入等量生理盐水稀释，混合均匀；3)另取新的离心管，加入淋巴细胞分离液，并将稀释后的下层血细胞溶液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面，所述下层血细胞溶液：淋巴分离液的体积比为1:1；4)2000rpm，离心15min；5)离心后将上层含有PBMC层液体吸出，转移至另一支离心管中，注意不要将红细胞层一并吸出；6)用一次性移液管加RPMI1640培养基重悬PBMC，500g离心5min，弃上清，即得所述PBMC。步骤6)中使用RPMI1640培养基重悬细胞，有利于保证细胞活性。本专利技术用于培养NK细胞的培养基使用灭活血浆，并创造性只使用一种细胞因子(IL-2)，能够大大降低NK细胞培养中的成本。本专利技术培养基用于培养NK细胞，操作步骤更简单，用时短，通过使用Lymactin-NK抗体进行细胞纯化培养，结合IL-2对细胞进行刺激增殖，扩增数量能达到2×109以上，获得的细胞数量充足；此外，本专利技术不仅仅局限于扩增NK细胞，还能够全方位提高NK细胞的生物活性，显著提高NK细胞的培养成功率，对NK细胞的培养具有重要的意义。附图说明图1为本专利技术方法制备的细胞中CD3-、CD56+的细胞含量的流式检测结果。图2为本专利技术方法制备的NK细胞杀伤效果。图3为专利CN201710876924.1方法制备的NK细胞杀伤效果。图4为专利CN201610905270.6方法制备的NK细胞杀伤效果。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1本专利技术用于培养NK细胞的培养基及其培养方法的实施例(一)制备PBMC和灭活血浆...

【技术保护点】
1.一种细胞培养基，其特征在于，所述培养基为含有体积百分比为5～20％的灭活血浆，以及500～1500U/mL IL-2的ALyS505NK-AC培养基。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞培养基，其特征在于，所述培养基为含有体积百分比为5～20％的灭活血浆，以及500～1500U/mLIL-2的ALyS505NK-AC培养基。


2.如权利要求1所述培养基，其特征在于，所述培养基中IL-2的浓度为1000U/mL。


3.如权利要求1所述培养基，其特征在于，所述灭活血浆的制备方法为：将血样于2000rpm离心15min，吸取上层血浆至新的离心管中；密封好置于56℃灭活20～50min；2500～3500rpm离心15min，取上层溶液即为所述灭活血浆。


4.如权利要求1所述培养基在诱导PBMC分化成NK细胞的用途。


5.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在培养容器中孵育15～20min的Lymactin-NK抗体，然后丢弃Lymactin-NK抗体液；
2)在步骤1)所述的容器中加入如权利要求1所述的培养基，并将PBMC接种于所述培养基中，该操作时间计为第0天；
3)于第3、5天进行补液，补加含有500～1500U/mLIL-2的ALyS505NK-AC培养基；
4)在第7天进行补液，补加含有500～1500U/mLIL-2的ALyS505NK-EX培养基；
5)在第9、11天进行补液，补加含有1000U/mLIL-2的ALyS505...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文东，宋云庆，黎波，卢瑞珊，
申请(专利权)人：广东华夏健康生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44