一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法技术

本发明专利技术提供了一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法，涉及抗体制备技术领域。本发明专利技术通过使用植物蛋白酶对卵黄抗体IgY进行水解消化，产生完整的有抗原结合活性的Fab段和有可结晶活性的Fc段。经所述水解后，即可利用盐析和离子交换层析相结合的方法进行简便有效的分离，从而得到Fab和Fc。经实施例验证，该方法纯化的Fab和Fc组分具有高纯度，Fab和Fc两个片段的纯度分别为88.7％和90.1％，与其他方法相比，该方法简单易行，分离出的活性片段易于使用。于使用。于使用。

【技术实现步骤摘要】
一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法


[0001]本专利技术属于抗体制备
，具体涉及一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法。

技术介绍

[0002]鸡卵黄抗体(IgY)是一种主要存在于鸡卵黄中重要的免疫球蛋白，其蛋白结构中有两个相同的Fab片段和一个Fc片段，IgY与哺乳动物IgG相比有很多优势，可以很容易地从鸡蛋中获得(100
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150mgIgY/每个蛋黄)；针对哺乳动物抗原具有高亲和力；与哺乳动物IgG的交叉反应较小；不激活或识别哺乳动物补体；不与类风湿因子(RF)发生反应。最近的研究表明，完整的免疫球蛋白片段对免疫反应具有显著影响。
[0003]Fab片段由部分H链(VH+CH1)和整个Lchain(VL+CL1)组成，具有抗原结合位点。由于Fc片段(抗原部分)的裂解，Fab片段已发展成为比完整抗体性能更好的抗菌剂，并广泛用于诊断学和生物制药研究。此外，由于其亲和结合能力，Fab片段可用作纯化研究中的配体。可结晶片段(Fc)通过与特定Fc受体的相互作用对触发免疫防御至关重要，其包含整个重链的两个或三个结构域，CH2、CH3和CH4。
[0004]利用Fc的糖基化可以设计出具有高治疗功效和药代动力学的抗体。许多研究人员还使用Fc区域研究了IgY转运到蛋黄中的机制。Vermeer，Norde和Van表明稳定的Fab和Fc片段可以在完整的免疫球蛋白中充当独立的亚基，并建议可以使用分离的Fab和Fc片段独立研究Fab和Fc的功能。因此，分别收集Fab和Fc片段是有意义的。
[0005]基于目前先进的重组DNA技术，可以利用哺乳动物细胞或大肠杆菌细胞进行瞬时表达，以获得合适的Fab和Fc片段，但是该方法非常昂贵，且有时合成的Fc不起作用；另有研究表明，菠萝蛋白酶可将IgY消化出Fc片段和Fab片段，但其主要为Fc3
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4(残基346
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566)，其大小为53kDa，而Fab的值为44kDa；同样的，应用胃蛋白酶时长将Fc片段水解成碎片，因此缺乏简便的方法从IgY中分离出有活性且完整的Fab和Fc。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法，可显著提高蛋白片段的完整度和纯度，方法简便并保持各片段活性。
[0007]本专利技术提供了一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法，包括以下步骤：使用植物蛋白酶水解卵黄抗体IgY，利用45％饱和度的硫酸铵溶液处理酶解液，离心收集沉淀；
[0008]将所述沉淀溶解后加载到DEAE
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Sepharose离子交换柱上，利用10mM Tris
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HCl缓冲液洗脱Fab部分；再用含有0.21MNaCl的10mMTris
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HCl缓冲液洗脱与DEAESepharose结合的Fc部分。
[0009]优选的，所述植物蛋白酶包括木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶。
[0010]优选的，所述水解的温度为37℃，时间为5h。
[0011]优选的，所述植物蛋白酶和卵黄抗体IgY的质量比为0.2:5。
[0012]优选的，所述水解时，将植物蛋白酶的溶液与卵黄抗体IgY的溶液混合；
[0013]其中植物蛋白酶的溶液的制备方法包括：将木瓜蛋白酶粉末溶解在含有20mM乙二胺四乙酸二钠盐的0.1M、pH7.0PBS中，并与终浓度为100mM的半胱氨酸混合，37℃孵育3小时，得植物蛋白酶的溶液；
[0014]所述卵黄抗体IgY的溶液以0.1M的PBS为溶剂。
[0015]优选的，在所述水解后，于冰上将酶解液与60mM碘乙酰胺混合，以终止反应。
[0016]优选的，在所述洗脱时，设置流速为1mg/mL。
[0017]有益效果：本专利技术通过使用植物蛋白酶对卵黄抗体IgY进行水解消化，产生完整的有抗原结合活性的Fab段和有可结晶活性的Fc段。经所述水解后，即可利用盐析和离子交换层析相结合的方法进行简便有效的分离，从而得到Fab和Fc。经实施例验证，该方法纯化的Fab和Fc组分具有高纯度，Fab和Fc两个片段的纯度分别为88.7％和90.1％，与其他方法相比，该方法简单易行，分离出的活性片段易于使用。
附图说明
[0018]图1为本专利技术分离与纯化的流程图；
[0019]图2为超滤对IgY消化的影响结果图；泳道1：蛋白质标记物；泳道2：IgY的植物蛋白酶消化物；泳道3：膜截断大小50kDa；泳道4：膜截断大小30kDa；
[0020]图3为IgY消化样品上硫酸铵的SDS
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PAGE分析结果图，泳道1：标记；泳道2
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8：从75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％饱和硫酸铵中获得的沉淀剂。
具体实施方式
[0021]本专利技术提供了一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法，流程如图1所示，包括以下步骤：使用植物蛋白酶水解卵黄抗体IgY，利用45％饱和度的硫酸铵溶液处理酶解液，离心收集沉淀；
[0022]将所述沉淀溶解后加载到DEAE
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Sepharose离子交换柱上，利用10mM Tris
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HCl缓冲液洗脱Fab部分；再用含有0.21MNaCl的10mMTris
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HCl缓冲液洗脱与DEAESepharose结合的Fc部分。
[0023]本本专利技术所述植物蛋白酶优选包括木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶，利用所述植物蛋白酶水解卵黄抗体后，可产生完整并保持活性的Fab段和Fc段。同时在两个抗体片段分离纯化中无需使用亲和柱和尺寸排阻柱组合即可分离植物蛋白酶消化物中的高纯度Fab和Fc片段。
[0024]本专利技术进行水解时，优选将植物蛋白酶的溶液与卵黄抗体IgY的溶液混合；其中植物蛋白酶的溶液的制备方法包括：将木瓜蛋白酶粉末溶解在含有20mM乙二胺四乙酸二钠盐的0.1M、pH7.0PBS中，并与终浓度为100mM的半胱氨酸混合，37℃孵育3小时，得植物蛋白酶的溶液；所述卵黄抗体IgY的溶液以0.1M的PBS为溶剂。本专利技术所述水解，以纯品计，所述植物蛋白酶和卵黄抗体IgY的质量比优选为0.2:5。本专利技术所述水解的温度优选为37℃，时间优选为5h。
[0025]本专利技术在所述水解后，优选还包括添加5mL的60mM碘乙酰胺并将其置于冰上1小时
来终止反应。本专利技术在终止反应后，优选还包括使用超滤装置浓缩水解产物，而后进行45％饱和度的硫酸铵溶液沉淀Fc和Fab片段，而后溶液在4℃下以10,000g离心15分钟，收集沉淀物。本专利技术在得到沉淀物后，优选还包括用蒸馏水重新溶解，使用超滤装置脱盐，然后冷冻干燥。
[0026]本专利技术优选利用DEAE琼脂糖离子交换层析分离IgY片段，具体地首先将冻干的IgY消化物以6mg/mL溶解在0.1MTris
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HCl(pH8.0)中，然后加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从卵黄抗体IgY中分离Fab和Fc片段的方法，其特征在于，包括以下步骤：使用植物蛋白酶水解卵黄抗体IgY，利用45％饱和度的硫酸铵溶液处理酶解液，离心收集沉淀；将所述沉淀溶解后加载到DEAE
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Sepharose离子交换柱上，利用10mM Tris
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HCl缓冲液洗脱Fab部分；再用含有0.21MNaCl的10mMTris
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HCl缓冲液洗脱与DEAESepharose结合的Fc部分。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述植物蛋白酶包括木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述水解的温度为37℃，时间...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽良，范首东，来永豪，张岩，张燚，焦洋，
申请(专利权)人：东沃同泰凤城生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：