作为有机和生物分子化学发光标记物的1,2-二氧杂环丁烷类化合物制造技术

本申请叙述了与有机和生物分子偶合产生标记物的具有下式的二氧杂环丁烷类化合物，＆其中Ｘ为用活化剂可以脱去而产生光的离去基团，Ａ为偶合取代基，Ａｒ为选自苯基和綦基的取代基。Ｒ－［１］为可以含有１～３０个和选自氧、硫、氮或磷杂原子以代替某几个碳原子的任意的连接基团。Ａｒ为苯基较好。偶合分子的二氧杂环丁烷可用于各种类型的试验，其中发光可以用作为显示剂。（*该技术在2011年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于试验等方面的与有机和生物分子具有结合能力的触发稳定的1，2-二氧杂环丁烷类化合物。特别是，本专利技术涉及与生物物质具有反应能力而实质上并不改变它们的基本功能的1，2-二氧杂环丁烷类化合物。1.稳定的1，2-二氧杂环丁烷类化合物的化学触发作用近来发现，热稳定的二氧杂环丁烷类化合物可以用化学和酶的方法进行触发，以便按照要求产生化学发光(A.P.Schaap，专利申请系列号887，139，1986年7月17日提交;A.P.Schaap，R.S.Handley和B.P.Giri，Tetrahedron Lett.，935(1987);A.P.Schaap，T.S.Chen，R.S.Handley，R.Desilva和B.P.Giri，Tetrahedron Lett.，1155(1987);和A.P.Schaap，M.D.Sandison，和R.S.Handley，Tetrahedron Lett.，1159(1987))。为此，已经研究出制备具有若干重要特征的二氧杂环丁烷类化合物的新的生产方法(1)应用具有稳定作用的螺稠合的金刚烷基，以便提供在环境温度下具有多年贮藏寿命的二氧杂环丁烷类化合物，(2)已经研究出了触发稳定的二氧杂环丁烷类化合物使之化学发光分解的新方法。应用三氯化钛/LAH于THF中使金刚烷酮与酮的芳香酯反应，制备所需的链烯烃(A.P.Schaap，美国专利4，857，652)。这是应用上述反应条件使酮与酯进行分子间缩合形成乙烯基醚的最早报道。虽然McMurry早已研究了酮与酯官能团的分子内反应，但是通过该方法制备的是环酮而不是乙烯基醚(J.E.McMurry和D.D.Miller，J.Amer.Chem.Soc.，105，1660(1983)以及J.E.McMurry，Chem.Rev.，89，1513(1989)). 将上述乙烯基醚光氧化、得到具有所需热稳定性的容易控制的二氧杂环丁烷类化合物。例如，下示的二氧杂环丁烷的活化能为24.8Kcal/mol，在25℃半衰期为3.8年。将该二氧杂环丁烷样品置于邻二甲苯中保持在实验台上数月，未检出分解作用。 但是，用氟化物离子脱去甲硅烷基保护基，可以在室温下容易地触发上述二氧杂丁烷化学发光分解，产生不稳定的芳基氧化物形式，经裂解得到强的蓝光。芳基氧化物取代的二氧杂环丁烷在25℃的半衰期为5秒。在DMSO中化学发光的光谱在470nm处具有最大值，这与在上述条件下酯分解产物(3-羟基苯甲酸甲基酯)的阴离子的荧光和余下的二氧杂环丁烷溶液的荧光是相同的。看来从金刚烷酮荧光似乎不会得到化学发光。以鲁米诺为标准，经测定氟化物触发分解的化学发光量子产额为0.25(或者说化学发光效率为25%)。在上述条件下(φF＝0.44)酯的荧光量子产额的修正量给予单纯激发酯的效率为57%，这是迄今报道的在实验室制备的二氧杂环丁烷最高的单纯化学激发效率。 2.稳定的1，2-二氧杂环丁烷类化合物的酶触发涉及酶的生物试验，如免疫试验和DNA杂交应用许多种类的底物，这些底物与酶反应或者形成颜色(显色的)，或者变成荧光(荧光的)。作为研究触发方法，已经发现起化学发光酶底物作用的最早的二氧杂环丁烷类化合物(A.P.Schaap，美国专利申请系列号887，139;A.P.Schaap，R.S.Handley，和B.P.Giri，Tetrahedron Lett.，935(1987);A.P.Schaap，T.S.Chen，R.S.Handley，R.Desilva，和B.P.Giri，Tetrahedron Lett.，1155(1987);A.P.Schaap，M.D.Sandison和R.S.Handly，Tetrahedron Lett.，1159(1987)和A.P.Schaap，Photochem.Photobiol.，47S，50S(1988)。上述过氧化物在生物系统中的应用要求二氧杂环丁烷类化合物在酶反应温度下是热稳定的，并且在水缓冲液中不会迅速的分解。在上面叙述的螺稠合的金刚烷基二氧杂环丁烷类化合物满足这些要求。制备的二氧杂环丁烷可以经酶作用变为产生芳基氧化物形式。该不稳定的中间体的分解产生荧光。已经合成的二氧杂环丁烷类化合物可以用触发各种不同的酶(包括芳基酯酶、乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酯酶和β-半乳糖苷酶)。 例如，以上所示磷酸酯取代的二氧杂环丁烷由碱性磷酸酯酶进行酶触发，磷酸酯取代的二氧杂环丁烷系由3-羟基-9H-咕吨-9-酮和金刚烷酮得到的。该二氧杂环丁烷是热稳定的，其活化能为30.7Kcal/mol，在25℃半衰期为12年。该二氧杂环丁烷不仅在有机溶剂中是稳定的，而且在水缓冲液中具有很慢的自发分解。在PH10.3于0.75M2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液中，应用牛肠粘膜的碱性磷酸酯酶和磷酸酯保护的二氧杂环丁烷进行触发试验。现已发现，总的光发射与该二氧杂环丁烷的浓度呈线性相关。发射衰减的速度是酶浓度的函数，而总的光发射与酶浓度无关。在室温和缓冲溶液中，得到磷酸酯酶催化分解的化学发光光谱。将在缓冲液中的该化学发光光谱与余下的反应混合物的荧光光谱和羟基咕吨酮分解产物的荧光光谱进行比较，结果表明由二氧杂环丁烷经磷酸酯基的酶裂解激发发射，得到不稳定的二氧杂环丁烷的芳基氧化物，它产生羟基咕吨酮单线激发态阴离子。 应用上述的磷酸酯保护的二氧杂环丁烷和碱性磷酸酯酶于pH9.6在0.75M2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液中，也可以进行磷酸酯酶触发实验，上述磷酸酯保护的二氧杂环丁烷是由3-羟基苯甲酸甲基酯和金刚烷制得的。向10-4·M的二氧杂环丁烷的溶液中加入酶，导致数分钟发射化学发光。在缓冲溶液中该二氧杂环丁烷的缓慢水解使本底发光很低，因此，在增强剂存在能检测出的碱性磷酸酯酶不足10-18mol(1attomol)(A.P.Schaap，H.Akhavan和L.J.，Romano，Clin.Chem.，35，1863(1989)和A.P.Schaap，美国专利申请系列号07/224，681和07/317，585)。3.用于生物试验的化学发光直接标记物(a)鲁米诺和异鲁米诺氨基邻苯二甲酰肼类(鲁米诺和异鲁米诺)在碱性条件下与H2O2和过氧化物酶催化剂反应放射出光。该反应还被少量的几种金属离子(包括Fe(Ⅲ)、Cu(Ⅱ)和Cr(Ⅲ))催化。用鲁米诺作为标记物的最早的化学发光免疫试验是由Schroeder报道的关于生物素的试验(H.R.Schroeder，P.O.Vogelhut，R.J.Carrico，R.C.Boguslaski，R.T.Buckler，Anal.Chem.48，1933(1976)).自此以后，又有一些应用鲁米诺作为标记物的报道(H.R.SchroederLuminescent ImmunoassaysPerspectives in Endocrinology and Clinical Chemistry，M.Serio and M.Pazzagli，Eds.，Raven Press，New york，pp 129-146(1982);M.Pazzagli，G.Messeri，A.L.Caldini，本文档来自技高网...

【技术保护点】
下式的二氧杂环丁烷化合物＊＊＊其中Ａｒ为选自苯基和萘基的芳香族取代基，Ａ为选自以下一组的取代基，该取代基化学上可与有机或生物分子偶合，并且该取代基物理上可与生物分子结合，得到位于该分子上的作为标记物的二氧杂环丁烷化合物，Ｒ↓ ［１］为任选的，并且可以是含有１～３０个碳原子和选自氧、氮、硫和磷杂原子以代替某几个碳原子的连接基团，Ｘ为化学上活泼的、可以用活化剂脱去的取代基，结果该二氧杂环丁烷产生光，并且其中＊＊为含有６～３０个碳原子的多环亚烷基取代基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：AP沙普，LJ罗马诺，JS古达，
申请(专利权)人：韦恩州立大学校董会，
类型：发明
国别省市：US[美国]