一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法技术

本发明专利技术公开一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法，将人脐带间充质干细胞接种于可变溶氧条件的3D生物反应器中，溶氧条件为常氧转低氧培养，常氧条件氧分压控制为50%，低氧条件氧分压控制为15%。本发明专利技术的有益效果是：在3D生物反应器内常氧转低氧条件下培养的脐带间充质干细胞外泌体表达量较常氧、低氧及低氧转常氧条件明显提高；适于批量生产，易于推动脐带来源间充质干细胞外泌体生物产品的工业化生产。业化生产。业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法


[0001]本专利技术属于人脐带间充质干细胞培养方法的
，它涉及一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法。

技术介绍

[0002]脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，其来源于中胚层具有高度自我更新和多向分化能力，因此具有广阔的临床应用前景。
[0003]外泌体是指直径在30
‑
150nm之间包含RNA、microRNA、蛋白质、DNA片段等的茶托型结构的小囊泡。人体几乎所有的细胞都可以分泌外泌体，其天然存在于体液中，包括唾液、尿液、脑脊液、血液和乳汁等。脐带间充质干细胞也不例外，在正常及病理状态下脐带间充质干细胞均可分泌外泌体。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。相比于脐带间充质干细胞，外泌体细胞因含有母细胞来源的蛋白质、脂质和核酸，并且因其分子量小、渗透性强等优点可作为信号分子作用于其它细胞。
[0004]目前脐带间充质干细胞体外主要是2D培养模式，常氧浓度的完全（血清）培养基中培养，完全培养基通常包含动物血清成分，动物源血清成分可能包含一些未知的过敏原和病原体，使得细胞培养过程中产生的外泌体具有极大的安全隐患，且2D条件下大规模培养具有较大的局限性。然而3D环境中常氧条件下采用无血清培养基培养的脐带间充质干细胞虽然贴壁生长状态较好、细胞活性较高，但是外泌体分泌量较低，限制了脐带来源间充质干细胞外泌体生物产品的推广应用。

技术实现思路
<br/>[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法，将人脐带间充质干细胞接种于可变溶氧条件的3D生物反应器中，溶氧条件为常氧转低氧培养。
[0007]优选地，常氧条件氧分压控制为50%，低氧氧分压在15
‑
25%。
[0008]优选地，具体步骤如下：对原代人脐带间充质干细胞培养扩增；将人脐带间充质干细胞接种于含有微载体的3D生物反应器中，开始常氧培养48
‑
72h，然后低氧培养48
‑
72h；培养结束后，收获细胞培养上清液，经分离纯化得到人脐带间充质干细胞外泌体。优选地，原代人脐带间充质干细胞经复苏、传代、扩增步骤。
[0009]优选地，3D生物反应器培养载体采用Cytodex 1微载体，接种浓度为2.5g/mL；细胞接种密度为1.6
×
10
5 cells/mL。
rpm，培养温度优选的为37℃，通气量设置为0.03
‑
0.1slpm，当生物反应器内生化监控值显示Gluc＜1 g/L，Glun＜0.1 g/L时，向生物反应器内以1 mL/min的速度自动灌流完全培养基，同时以相同速度将生物反应器内的培养上清灌出收集。
[0019]培养过程中，常氧条件DO为50%，低氧条件DO为15
‑
25%；氧分压是通过向生物反应器中的培养基内引入空气、二氧化碳、氧气和氮气来实现的，低氧条件是所述的空气、二氧化碳、氧气和氮气通过气体分布器处理后，生物反应器内的最终氧分压控制在15
‑
25%。上述的氧含量能够为生物反应器内培养的脐带间充质干细胞提供生长繁殖所需的基本条件又能提高其外泌体的表达量。
[0020]生物反应器内细胞低氧条件下培养72 h后上清送检无菌、支原体监控微生物安全性，细胞送检表型检测。生物反应器取样口取样进行日监控，分别进行上清生化指标测定，上清离心
‑
80℃保存留样及Tryple消化酶消化细胞计数。
[0021]培养后对3D生物反应器中培养的脐带间充质干细胞取样后用Tryple消化酶将细胞从Cytodex 1微载体上消化下来，送检流式测定细胞表型，CD73、CD90、CD105≥95%， CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA
‑
DR≤2%，即为符合标准细胞。收获细胞培养上清倒入离心杯中，2500g离心15min，转移至无菌试剂瓶，
‑
80℃保存，收集得到的上清可用于提取外泌体。
[0022]下面结合附图对本专利技术方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。本专利技术具体实施例中使用的生物反应器为武汉赛科成科技有限公司研发的SKC300生物反应器；所使用的生物反应器的容积为2.5L；本专利技术中生化分析仪为西尔曼科技有限公司的全自动生化分析仪M
‑
900。
[0023]实施例1本实施例1中将人脐带来源间充质干细胞接种于3D生物反应器中，细胞的低氧培养方法，包括以下步骤：将来源于工作细胞库的原代人脐带间充质干细胞进行复苏，工作库细胞迅速转移到37℃水浴锅中，轻轻晃动融化；洁净工作台内，细胞冻存液转移至加有完全培养基的离心管中；400g离心5min后，弃上清，加入适量完全培养基重悬细胞，充分混匀后细胞计数。
[0024]按照每平方厘米1
Í
104个细胞密度接种于T175细胞培养瓶内，将含有细胞的培养瓶放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养，细胞融合度达到80%
‑
90%后，收集细胞并进行细胞传代，在2D条件下将hMSCs传代培养至3D生物反应器所需数量的种子细胞，完全培养基为无血清间充质干细胞培养基。
[0025]种子细胞接种于3D生物反应器培养，以Cytodex 1微载体2.5g/L，15 cells/ball的接种浓度，细胞接种至2.5L生物反应器中，以1.5L培养体系进行培养。先常氧培养48h，再低氧培养72h，常氧条件DO为50%，低氧条件DO为15%。
[0026]本实施例中生物反应器内最佳pH值为7.3
±
0.1，最佳搅拌转速为80 rpm，培养温度优选为37℃，通气量设置为0.03
‑
0.1slpm，常氧条件氧分压控制为50%，细胞培养48h，低氧条件氧分压控制为15%，细胞培养72h。上述氧分压调节是通过向生物反应器中的培养基内引入空气、二氧化碳、氧气和氮气来实现的，低氧条件是所述的空气、二氧化碳、氧气和氮气通过气体分布器处理后，生物反应器内的最终氧分压分别控制在50%和15%。细胞培养日监测样品取自生物反应器单向取样口，样品经全自动生化分析仪检测葡萄糖、乳酸、谷氨酰
胺等生化指标，当生物反应器内生化监控值显示Gluc＜1 g/L，Gln＜0.1 g/L时，向生物反应器内以1 mL/min的速度自动灌流完全培养基，同时以相同速度将生物反应器内的培养上清灌出收集，灌流培养结束后取样检测细胞培养上清中外泌体含量。
[0027]对比例对比例包括3个，种子细胞接种于3D生物反应器中，与实施例1 的不同之处在于培养条件，3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法，其特征在于：将人脐带间充质干细胞接种于可变溶氧条件的3D生物反应器中，溶氧条件为常氧转低氧培养。2.根据权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法，其特征在于：常氧条件氧分压控制为50%，低氧氧分压在15
‑
25%。3.根据权利要求1或2所述的提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法，其特征在于：具体步骤如下：对原代人脐带间充质干细胞培养扩增；将人脐带间充质干细胞接种于含有微载体的3D生物反应器中，开始常氧培养48
‑
72h，然后低氧培养48
‑
72h；培养结束后，收获细胞培养上清液，经分离纯化得到人脐带间充质干细胞外泌体。4.根据权利要求3所述的提高脐带间充质干细胞外泌体表达量的方法，其特征在于：原代人...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，董凤伟，陆路，王淼，杜焕青，
申请(专利权)人：天津外泌体科技有限公司，
类型：发明
国别省市：