【技术实现步骤摘要】
一种用于改善卵母细胞质量的自体线粒体
[0001]本申请是名为《骨髓间充质干细胞的线粒体在改善卵母细胞药物中的应用》的专利申请的分案申请，原申请的申请日为2019年02月25日，申请号为201910139497.8。
[0002]本专利技术涉及生物医学工程
，特别是涉及一种用于改善卵母细胞质量的自体线粒体。
技术介绍
[0003]卵子质量差是导致辅助生殖反复失败的重要原因。线粒体数目的减少与卵母细胞衰老有关，功能障碍的线粒体会影响卵母细胞成熟的晚期阶段和早期胚胎形成。因此，关于改善卵子质量的研究主要集中在改善线粒体的功能上。
[0004]研究或临床应用阶段用于改善卵子质量的方法有：1)线粒体活化剂：生长激素、辅酶Q10、白藜芦醇、左旋肉碱、α
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硫辛酸，其中，临床常用生长激素、辅酶Q10改用于善卵子质量，其余活化剂应用较少；2)线粒体替代治疗：细胞浆移植、核移植、纺锤体移植和极体移植；线粒体替代治疗还处于实验研究阶段，未进入临床应用中。
[0005]目前，暂无有效改善卵子质量的药物或方法；原因在于上述两种方法均存在许多不足：1)线粒体活化剂疗效不确切、不显著，效果有限；2)在线粒体替代治疗中，异体细胞移植因会形成三亲胚胎的伦理问题；3)在线粒体替代治疗中，不同个体来源的线粒体DNA与核基因组合后，暂无系统评估后代的健康风险，不可预测；4)线粒体替代治疗的效果不稳定。
[0006]因此，有必要研发一种用于改善卵母细胞质量的自体线粒体。
技术实现思路
>[0007]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种用于改善卵母细胞质量的自体线粒体。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0009]一种用于改善卵母细胞质量的自体线粒体，包含骨髓间充质干细胞的线粒体；所述卵母细胞的线粒体功能差；所述骨髓间充质干细胞的线粒体是通过以下步骤进行提取：
[0010]S1)复苏骨髓间充质干细胞，进行消化处理；消化后，骨髓间充质干细胞收集到容器中；
[0011]S2)离心弃上清，再向容器中加入PBS缓冲液进行重悬；骨髓间充质干细胞悬浮后，离心弃上清；
[0012]S3)向容器中加入预冷的Mito
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CytoBuffer进行重悬，重悬后转移至另一容器中，并放入冰块；对骨髓间充质干细胞混合液进行多次抽吸；
[0013]S4)将骨髓间充质干细胞的匀浆物转移到另一容器中，离心、收集上清液；
[0014]S5)对步骤S4收集的上清液继续离心，收集上清液；
[0015]S6)重复步骤S5；
[0016]在步骤S1之前还包括：骨髓间充质干细胞的分离、接种；所述骨髓间充质干细胞的分离、接种的具体步骤包括：
[0017]1)在骨髓血样中加入PBS混匀，用离心管分装2管ficoll淋巴细胞分离液，将稀释骨髓缓慢加入ficoll液面上，水平离心机进行离心；
[0018]2)从界面上取出的MNC并加入离心管内；
[0019]3)加入PBS重悬，离心后弃上清；重复一次该步骤，并细胞计数；
[0020]4)将细胞种入六孔板中，每孔加培养液，细胞密度不少于2
×
105/孔；
[0021]5)在CO2体积分数5％、湿度95％以上和温度37℃条件下培养箱中静置培养，3～5天更换一次培养液；
[0022]6)待每孔细胞汇合度为80％～90％时，弃去培养液，用适量PBS液洗涤2次；
[0023]7)用EDTA胰蛋白酶，消化后终止胰酶作用；
[0024]8)用吸管反复吹打后将细胞收集于离心管中，加PBS，并离心，弃去上清；
[0025]所述药物中骨髓间充质干细胞的线粒体DNA拷贝数为4000～5000个。
[0026]根据本专利技术提供的具体实施例，本专利技术公开了以下技术效果：
[0027]1)本专利技术选择了一种高质量来源(骨髓间充质干细胞)的线粒体，治疗效果显著，成功使一名因胚胎质量差反复移植失败的女性妊娠、并分娩一健康婴儿；
[0028]2)本专利技术不存在异体细胞线粒体移植的问题，从而不会导致“三亲”子代的伦理隐患，也不会因不同来源的线粒体
‑
核基因组合使后代的健康存在潜在风险；
[0029]3)本专利技术提供了一种标准化的技术流程，使技术更稳定，疗效更稳定。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0031]图1为显示骨髓间充质干细胞的分离培养及线粒体的提取；
[0032]图2为分离的骨髓间充质干细胞的鉴定；
[0033]图3为线粒体的电镜图；其中，3A来源于患者卵母细胞，3B来源于患者骨髓间充质干细胞；
[0034]图4显示线粒体的膜电位；
[0035]图5显示卵母细胞接受线粒体注射；其中，5A为线粒体注射过程，5B显示线粒体注射入卵母细胞内，5B图中白色亮点为线粒体和荧光标记的精子；
[0036]图6显示骨髓间充质干细胞线粒体注射卵母细胞后，囊胚发育良好。
具体实施方式
[0037]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0038]在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
[0039]本申请的说明书和权利要求书及所述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”等是用于区别不同对象，而不是用于描述特定顺序。此外，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤、过程、方法等没有限定于已列出的步骤，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤元。
[0040]骨髓间充质干细胞的分离、接种
[0041]1)在20ml骨髓血样中加入10mlPBS混匀，用50ml离心管分装2管ficoll(密度1.077)淋巴细胞分离液15ml，将稀释骨髓缓慢加入ficoll液面上，水平离心机700g离心25min；
[0042]2)从界面上取出的MNC(云雾状层细胞)并加入50ml离心管内；
[0043]3)加入PBS15ml重悬本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于改善卵母细胞质量的自体线粒体，其特征在于，包含骨髓间充质干细胞的线粒体；所述卵母细胞的线粒体功能差；所述骨髓间充质干细胞的线粒体是通过以下步骤进行提取：S1)复苏骨髓间充质干细胞，进行消化处理；消化后，骨髓间充质干细胞收集到容器中；S2)离心弃上清，再向容器中加入PBS缓冲液进行重悬；骨髓间充质干细胞悬浮后，离心弃上清；S3)向容器中加入预冷的Mito
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CytoBuffer进行重悬，重悬后转移至另一容器中，并放入冰块；对骨髓间充质干细胞混合液进行多次抽吸；S4)将骨髓间充质干细胞的匀浆物转移到另一容器中，离心、收集上清液；S5)对步骤S4收集的上清液继续离心，收集上清液；S6)重复步骤S5；在步骤S1之前还包括：骨髓间充质干细胞的分离、接种；所述骨髓间充质干细胞的分离、接种...
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