间充质干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，具体涉及间充质干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用。本发明专利技术采用经超声照射预处理后的间充质干细胞释放的外泌体对成纤维细胞进行干预培养24h，CCK

【技术实现步骤摘要】
间充质干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于细胞培养
更具体地，涉及间充质干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]外泌体是一种直径约为30
‑
150nm的细胞外囊泡，其含有丰富的mRNA、microRNA和蛋白质、胆固醇等成分，其最早于1987年被Ebrehard G.Trams和R.M.Johnstone在体外培养的绵羊红细胞上清中发现，并将其命名为外泌体。
[0003]采用脐带间充质干细胞释放的外泌体进行组织修复具有较多优点：安全性好，作用效率快，作用精确且来源易得。外泌体可以通过与靶细胞膜外受体结合、通过质膜融合或胞吞作用、酶切作用进入靶细胞，从而对靶细胞的蛋白质和基因表达进行调控，影响细胞的增殖、迁移、免疫调节以及血管再生等过程。HSF是主要产生胶原蛋白及其他细胞外基质成分的细胞，其对皮肤创面愈合起重要的调控重要，因此，在创面愈合早期促进HSF增殖或迁移可增加细胞外基质的沉积，促进创面收缩，为创面愈合提供基础。已有报道多能间充质干细胞、富血小板血浆和ucMSCS可以通过促进成纤维细胞的增殖和细胞外基质的再生来加速上皮化。
[0004]目前已知通过细胞因子、低氧/缺氧、缺血、激素和物理干预等预处理方式能够调节间充质干细胞的分泌模式和旁分泌内容物组分。如，LI等
[1]研究发现，脂多糖预处理人胸腺间充质基质细胞产生的外泌体，可抑制T细胞增殖，促进炎症因子分泌，促使免疫细胞发生促炎分化，加速了炎症的发生。但目前未见研究超声照射诱导培养的间充质干细胞释放的外泌体对HSF增殖及合成相关细胞因子的影响。
[0005]参考文献[1]：LI Q,LI J,SUN L,etal.Exosomes derived from LPS
‑
stimul ated human thymic mesenchymal stromal cells enhance inflammation viathromb ospondin
‑
1.Biosci Rep.2021；41(10):BSR20203573.

技术实现思路

[0006]专利技术人意外发现，超声照射对间充质干细胞外囊泡的产生及释放的内容物组分有着重要的调控作用，而低强度超声照射处理脐带间充质干细胞产生的外泌体加速了小鼠伤口的愈合，与对照组存在差异性。
[0007]因此，本专利技术的一个目的是提供一种制备间充质干细胞外泌体制剂的方法，包括以下步骤:
[0008]a：超声照射预处理间充质干细胞；
[0009]b：培养上述间充质干细胞，收集释放的外泌体。
[0010]进一步地，所述超声照射的强度为420～750mW/cm2。优选采用低强度的超声进行照射，因为这样更有利于获得预期的外泌体，经过多次试验结果显示，采用超声强度范围在420～750mW/cm2内是比较理想的，更优选为550mW/cm2(前期试验筛选)，这时候产生的外泌
体具有明显的促进HSF增殖和迁移能力，且含有更多的TGF
‑
β1、IL
‑
6等。而高强度的超声照射一定程度上反而抑制间充质干细胞的增殖。
[0011]由表1可知，采用1μg/ml经超声照射预处理后的间充质干细胞释放的外泌体培养HSF 24h后，HSF增殖相对活力值与未经超声照射组相比存在极显著地差异(P＜0.01)；超声照射预处理组的间充质干细胞释放的外泌体中含有更高水平的TGF
‑
β1、IL
‑
6和IL
‑
8，与未经超声照射组相比差异具有统计学意义(P＜0.05)。
[0012]进一步地，所述超声照射预处理间歇性进行。进一步实验发现，间歇性地低强度超声辐射将会使得这种加速效果更加明显，这可能与其促进成纤维细胞增殖及合成相关愈合因子有关。
[0013]进一步地，所述间歇性进行超声照射预处理具体是指：在强度为420～750mW/cm2的超声照射下处理10～20min，停止超声照射10～20min，如此进行1～3个循环。
[0014]进一步地，所述间歇性进行超声照射预处理具体是指：在强度为550mW/cm2的超声照射下处理15min，停止超声照射10min，如此进行3个循环。
[0015]由表2可知，间歇超声照射组HSF细胞相对活力值显著地高于持续超声照射组(P＜0.05)，且外泌体中含有更多的TGF
‑
β1、IL
‑
6和IL
‑
8。
[0016]进一步地，所述步骤b采用含10％血清的DMEM培养基培养间充质干细胞。虽然本专利技术限定了采用DMEM培养基培养所述间充质干细胞，但是原则上，凡是能够维持间充质干细胞增殖生长的培养基均在本专利技术包涵的范围内。
[0017]进一步地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞。更优选为脐带间充质干细胞。
[0018]本专利技术另一目的在于提供所述方法制备的间充质干细胞外泌体制剂。
[0019]本专利技术另一目的在于提供所述间充质干细胞外泌体制剂在制备促进皮肤创面愈合药物中的用途。
[0020]本专利技术有益效果：
[0021]成纤维细胞作为新生组织形成及组织重塑期的重要组织修复细胞，在组织修复过程中和创面收缩过程中具有至关重要的作用，本专利技术采用间歇性超声照射预处理后的间充质干细胞释放的外泌体对成纤维细胞进行干预培养24h，CCK
‑
8试验表明，其能够显著地促进人皮肤成纤维细胞增殖，提高成纤维细胞合成相关愈合因子的水平，小鼠急性皮肤创面模型表明，注射外泌体制剂的小鼠创面愈合速度显著优于对照组。
具体实施方式
[0022]通过下面的实施例可以对本专利技术进行进一步的描述，然而，本专利技术的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本专利技术的精神和范围的前提下，可以对本专利技术进行各种变化和修饰。
[0023]试验例一、
[0024]1.材料与方法
[0025]1.1脐带间充质干细胞预处理：按照常规技术分离得到80％融合的原代脐带间充质干细胞，按照1:4的比例传代，收集P2代细胞，并将细胞随机分为三组，分别是未经超声照射预处理组、持续超声照射组(550mW/cm2持续照射75min)、间歇性超声照射组(强度为
550mW/cm2的超声照射下处理15min，停止超声照射10min，如此进行3个循环)，三组细胞均采用高糖DMEM培养基培养，分别置于上述三组相应条件下进行预处理。
[0026]1.2细胞培养、传代：将上述预处理后的三组细胞采用含10％血清的高糖DMEM培养基在37℃、5％CO2的条件下进行培养及按照1:4的比例传代至P8代，收集P2代～P8代培养上清，2000g离心10min去除细胞和细胞碎片；收集上清液，10000g高速离心30min；收集上清，100000g高速离心100min，收本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备间充质干细胞外泌体制剂的方法，其特征在于，a：超声照射预处理间充质干细胞；b:培养上述间充质干细胞，收集释放的外泌体。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声照射的强度为420～750mW/cm2。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述超声照射预处理间歇性进行。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述间歇性进行超声照射预处理是指：在强度为420～750mW/cm2的超声照射下处理10～20min，停止超声照射10～20min，如此进行1～3个循环。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：温楠，
申请(专利权)人：广州绿雅生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：