细胞外囊泡-甲氨蝶呤偶联物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开一种细胞外囊泡

【技术实现步骤摘要】
细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联物及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于生物纳米药物的合成与制备领域，尤其是涉及一种细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联物及其制备方法与应用
。

技术介绍

[0002]甲氨蝶呤
(Methotrexate,MTX)
为抗叶酸类抗肿瘤细胞毒药物，除用于治疗各类急性白血病
(
如急性淋巴细胞白血病
)
，对实体瘤
(
如脑胶质瘤
)
也有一定的疗效，属于临床基本抗肿瘤药物
。MTX
与叶酸的结构类似，能够有效结合二氢叶酸还原酶活性位点，从而竞争性阻遏叶酸被还原为有生理活性的四氢叶酸，进而影响嘌呤核苷酸及嘧啶核苷酸的生物合成过程，导致细胞的
DNA
合成受阻
。
此外，
MTX
还能够选择性作用于
DNA
合成期
(S
期
)
的细胞，属于细胞周期特异性药物，对
G1/S
期的细胞也有延缓作用
。
但脑胶质瘤细胞对
MTX
具有一定的抗药性，且
MTX
不具备靶向性，穿越血脑屏障的能力较弱，需要增加用药剂量来维持药效，但也不可避免地会对正常组织细胞造成损伤
(
如肝肾损伤
)。
因此，亟需一种在不产生毒副作用的前提下能够有效提升
MTX
药效的方法及药物递送系统
。
[0003]细胞外囊泡
(Extracellular Vesicle,EVs)
是一类由活细胞分泌，直径在
30
～
1000nm
范围，具备磷脂双分子层膜结构且包覆有多肽
、
蛋白质以及核酸等多种生物分子的生物纳米囊泡
。
细胞外囊泡作为新型内源性载体，一般通过膜融合或受体介导等方式将所包覆的生物分子传递至受体细胞，在细胞间物质交换及信息传递方面发挥着重要作用
。
细胞外囊泡基于自身的纳米效应，良好的生物相容性，以及天然的分子递送属性，作为新型内源性药物载体在药物递送领域具有巨大的应用潜力
。
此外，相对于人工脂质体
(liposomes)、
胶束
(micelles)
以及纳米离子
(nanoparticles)
，细胞外囊泡除具备低免疫原性外，还具有天然的体内长循环的优势，特别适于递送易降解失活的药物分子
。
近年来越来越多的研究表明，细胞外囊泡可用于装载并递送小分子化学药物
、
多肽以及
siRNA、mRNA
等核酸类药物分子，在肿瘤
、
心血管疾病的治疗方面体现出极大的应用价值
。
[0004]此外，有研究证明，细胞外囊泡作为内源性药物载体能够无障碍穿越血脑屏障，因此可构建基于细胞外囊泡的药物递送系统，提高治疗脑肿瘤药物的血脑屏障通透性，用以改善药物治疗效果
。
但目前基于细胞外囊泡的成功治疗脑肿瘤的方法较少，且大多存在药效不理想，成本较高且安全性难以保障等问题，难以实现临床转化
。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联物及其制备方法与应用
。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：一种细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联物，甲氨蝶呤偶联在细胞外囊泡外表面的脂膜上
。
[0007]细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联物制备方法，对甲氨蝶呤的羧基进行活化，将羧基活化的甲氨蝶呤与细胞外囊泡混合孵育，甲氨蝶呤分子中的活化后的羧基通过生物正交反应偶
联在细胞外囊泡表面，获得细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联物
。
[0008]优选地，甲氨蝶呤分子中的活化后的羧基通过生物正交反应与细胞外囊泡脂膜表面的氨基缩合偶联
。
[0009]优选地，羧基活化的甲氨蝶呤结构如式1所示；
[0010][0011]优选地，通过碳二亚胺与
N
‑
羟基琥珀酰亚胺组成的交联剂活化甲氨蝶呤的羧基，碳二亚胺
、N
‑
羟基琥珀酰亚胺和甲氨蝶呤的摩尔比为1‑
1.2:1
‑
1.3:1。
[0012]优选地，所述碳二亚胺为二环己基碳二亚胺或1‑
(3
‑
二甲氨基丙基
)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐
。
[0013]优选地，孵育条件为以超纯水
、
生理盐水或
PBS
缓冲液为溶剂，
25
‑
37℃
反应
0.5
‑
2h。
[0014]优选地，细胞外囊泡为来源于奶源
、
血液
、
尿液或干细胞的细胞外囊泡
。
[0015]细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联物在甲氨蝶呤药物中的应用
。
[0016]本专利技术具有的优点和积极效果是：通过将甲氨蝶呤偶联在细胞外囊泡上，实现高效载药过程，再通过细胞外囊泡作用实现递药，从而实现甲氨蝶呤高药效表达；将羧基活化的甲氨蝶呤与细胞外囊泡脂膜表面的氨基缩合偶联，通过生物正交反应将甲氨蝶呤与细胞外囊泡偶联；这种化学偶联过程不影响细胞外囊泡的形态学
、
膜结构及脂膜表面蛋白标志物，有助于细胞外囊泡的药物装载与递送功能的研究，并且生物正交反应条件温和
、
无毒
、
高效且操作简便
。
[0017]通过本专利技术所述的甲氨蝶呤与细胞外囊泡的偶联方法能够将甲氨蝶呤成功偶联到细胞外囊泡脂膜表面，包封率与载药率均超过
50
％；本专利技术通过生物正交方法实现在细胞外囊泡上偶联化学药物，在体内外对脑胶质瘤细胞生长的抑制效果均优于常规使用的甲氨蝶呤，取得了良好的抗肿瘤效果，为开发细胞外囊泡偶联药物及基于细胞外囊泡的药物递送系统提供了新策略
。
附图说明
[0018]图1为实施例2的羧基活化的甲氨蝶呤与细胞外囊泡的偶联方法及细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联药物的制备路线图；
[0019]图2为实施例2获得的细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联药物结构图；
[0020]图3为实施例
2、
对比例1与对比例2中药物种类及数量分析，其中图
3A
为药物种类分析，图
3B
为药物数量分析
(
载药率与包封率
)
，其中
MTX
‑
STD
表示甲氨蝶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联物，其特征在于：甲氨蝶呤偶联在细胞外囊泡外表面的脂膜上
。2.
制备权利要求1所述的细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联物的方法，其特征在于：对甲氨蝶呤的羧基进行活化，将羧基活化的甲氨蝶呤与细胞外囊泡混合孵育，甲氨蝶呤分子中的活化后的羧基通过生物正交反应偶联在细胞外囊泡表面，获得细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联物
。3.
根据权利要求2所述的细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联物制备方法，其特征在于：甲氨蝶呤分子中的活化后的羧基通过生物正交反应与细胞外囊泡脂膜表面的氨基缩合偶联
。4.
根据权利要求2所述的细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联物制备方法，其特征在于：羧基活化的甲氨蝶呤结构如式1所示；
5.
根据权利要求4中任一所述的细胞外囊泡
‑
甲氨蝶呤偶联物制备方法，其特征在于：通过碳二亚胺与
N
‑
羟基琥珀酰亚胺组成的交联剂活化甲氨蝶呤的羧基，碳二亚胺
、N
‑
羟基琥珀酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，王达，董凤伟，沈生强，肖更午，王淼，韩春乐，马德美，赵刚刚，
申请(专利权)人：天津外泌体科技有限公司，
类型：发明
国别省市：