一种提升外泌体稳定性的方法及外泌体保存液技术

本发明专利技术公开一种提升外泌体稳定性的方法及外泌体保存液，外泌体保存液由果胶和/或海藻酸钠与磷酸盐缓冲液混合得到，使用时，先将外泌体保存液加热制成胶体溶液，再加入新鲜外泌体，封存后可在常温条件下长期保存外泌体，保护液能够提高外泌体体系带电量，避免外泌体在粒径、浓度和活性上的变化，保护外泌体的完整性，稳定性，使得外泌体能够长期保持其生物活性，并保持其内含物的稳定性。并保持其内含物的稳定性。并保持其内含物的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种提升外泌体稳定性的方法及外泌体保存液


[0001]本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种提升外泌体稳定性的方法及外泌体保存液。

技术介绍

[0002]外泌体(exosomes)是一类大多数细胞分泌产生的纳米级胞外囊泡。外泌体中含有mRNA、miRNA、蛋白质和脂质等成分。2013年詹姆斯
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罗斯曼、兰迪
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谢克曼和托马斯
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聚德霍夫因发现囊泡转运机制获得诺贝尔生理学或医学奖。作为一类重要的胞外囊泡，外泌体因其具有免疫调节、呈递抗原、参与细胞间信号转导以及用于疾病诊断和治疗等功能而受到广泛关注。在深入研究外泌体前，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要的步骤，也是一切后续实验的基础，只有高活性、高稳定性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。
[0003]现有的外泌体体外保存常采用低温保存，但是临床应用是在常温下使用的，这就导致在其保存、应用时分别需要增加降温、升温步骤，而且这种降温、升温必须非常缓慢，费时费事。为保证其活性，其保存时间应尽量控制在6小时之内，这个时间是非常紧张的，对距离稍长的运输是一个挑战。目前外泌体只能在2～8℃稳定保存3至7天，
‑
20℃稳定保存1个月。长期保存需要
‑
80℃低温，并且不能冻融，存储条件要求高，这些缺点影响了外泌体的深入研究。由此，如何有效地体外保持外泌体的稳定性，有效保持外泌体的完整性、理化性质仍有待开发。目前，外泌体保存液种类极少，并且其保存液保存效果不佳，容易造成外泌体在保存过程中结构被破坏，生物活性丧失，或内含物降解，影响对外泌体的后续检测、标记等下游的研究或应用。
[0004]胶体分散体系中的Zeta电位测定是一个重要的检测项目。Zeta电位的主要的用途之一就是研究胶体与电解质的相互作用。 Zeta电位(正或负)越高，体系越稳定，即溶解或分散可以抵抗聚集。Zeta电位是用来表征胶体分散系稳定性的重要指标。运用新型的检测方法和成果来解决外泌体保存中的实际问题，为外泌体的稳定保存建立技术基础。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种提升外泌体稳定性的方法及外泌体保存液。
[0006]本专利技术采用的技术方案是：一种提升外泌体稳定性的方法，由果胶和/或海藻酸钠与磷酸盐缓冲液混合得到外泌体保存液，将外泌体保存液加热处理制成胶体溶液，再将外泌体保存于冷却到室温的胶体溶液中，低温或常温保存。
[0007]优选地，外泌体保存液中包括果胶0.1
‑
0.5%（w/w），和/或包括海藻酸钠0.1
‑
0.5%（w/w）。
[0008]优选地，外泌体保存液由0.3%（w/w）果胶和/或0.5%（w/w）海藻酸钠与磷酸盐缓冲液混合得到。
[0009]优选地，将外泌体保存液置于60
‑
80℃加热5
‑
25min，形成胶体溶液。
[0010]优选地，取5 mL蛋白含量为250
‑
300 μg/mL牛奶外泌体浓缩到150
µ
L，加入等体积的外泌体保存液，保存。
[0011]一种外泌体保存液，通过磷酸盐缓冲液配置果胶和/或海藻酸钠得到外泌体保存液。
[0012]优选地，外泌体保存液中包括果胶0.1
‑
0.5%（w/w），和/或包括海藻酸钠0.1
‑
0.5%（w/w）。
[0013]本专利技术具有的优点和积极效果是：通过上述方法保存外泌体，能够在常温条件下长期保存外泌体，保护液能够提高外泌体体系带电量，避免外泌体在粒径、浓度和活性上的变化，保护外泌体的完整性，稳定性，使得外泌体能够长期保持其生物活性，并保持其内含物的稳定性；常温的保存条件也避免了升温降温的步骤，操作简单，省时省力。
附图说明
[0014]图1为实验例牛奶外泌体表征图；图2为样本1
‑
9在常温条件下果胶和海藻酸钠对牛奶外泌体Zeta电位的影响结果；图3为样本1
‑
6在常温条件下的牛奶外泌体标记分子western blot结果图；PC：阳性对照；NC：阴性对照；图4为样本7
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9在常温条件下保存了28天的外泌体标记分子western blot结果图；图5为样本7
‑
9在常温条件下保存了28天的外泌体形态结果图。
具体实施方式
[0015]下面结合附图对本专利技术的实施例做出说明。
[0016]本专利技术涉及一种外泌体提升稳定性的方法，具体为一种在常温状态下提升外泌体稳定性的保存方法。采用一种外泌体保存液，外泌体保存液由果胶和/或海藻酸钠与PBS缓冲液混合得到，先通过磷酸盐缓冲液配置果胶和/或海藻酸钠，得到外泌体保存液，在用于保存外泌体前，先将外泌体保存液通过加热制成胶体溶液，冷却到室温后加入外泌体即可常温保存。
[0017]通过添加果胶和海藻酸钠提升牛奶外泌体 Zeta 电位绝对值，使其在2～8℃或室温下仍可以长期保持形态结构和生物活性，且内含物稳定性较好。外泌体保存液中海藻酸钠的添加，对外泌体具有较好的保护作用，在低温条件下海藻酸钠能在外泌体表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持外泌体的生物活性；果胶本质上是一种线形的多糖聚合物，含有数百至约1000个脱水半乳糖醛酸残基，其相应的平均相对分子质量为50000
‑
150000。果胶链很短，无法在水中形成连接在一起的长链，同时加热会使得果胶链两端携带负电荷，从而使它们之间互相排斥，形成粘稠的无味溶液。果胶的添加，果胶能显著提升经过热处理和未经过热处理的牛奶外泌体的Zeta电位绝对值，从而提高外泌体的稳定性；磷酸盐缓冲液与外泌体自然状态下的pH值、渗透压一致，具有维持外泌体渗透压、控制酸碱平衡的作用，同时磷酸盐缓冲溶液易与Ca
2+
离子、Mg
2+
离子以及重金属离子缔合生成沉淀，抑制外泌体内的生物化学反应以及多数酶的活性，进一步保护外泌体结构的完整性以及内含物的稳定性。因此外泌体保存液能长期保持外泌体的完整性、生物
活性以及内含物稳定性。
[0018]本专利技术某些实施例中，先将PBS (pH=7.4)过0.22
ꢀµ
m膜除菌，再通过PBS配制果胶和/或海藻酸钠得到外泌体保存液，外泌体保存液中包括果胶0.1
‑
0.5%，和/或包括海藻酸钠0.1
‑
0.5%。使用外泌体保存液保存新鲜外泌体时，先通过加热将外泌体保存液制备成胶体溶液，具体可将外泌体保存液置于60
‑
80℃加热5
‑
25min，震荡混匀，形成胶体溶液；向冷却后的胶体溶液中加入新鲜外泌体后，即可用于常温状态下保存。根据储存条件，还可浓缩处理后储存。
[0019]本专利技术所设计的外泌体提升稳定性的储存方法适用于多种外泌体，尤其适合牛奶外泌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提升外泌体稳定性的方法，其特征在于：由果胶和/或海藻酸钠与磷酸盐缓冲液混合得到外泌体保存液，将外泌体保存液加热处理制成胶体溶液，再将外泌体保存于冷却到室温的胶体溶液中，浓缩后低温或常温保存。2.根据权利要求1所述的提升外泌体稳定性的方法，其特征在于：外泌体保存液中包括果胶0.1
‑
0.5%（w/w），和/或包括海藻酸钠0.1
‑
0.5%（w/w）。3.根据权利要求2所述的提升外泌体稳定性的方法，其特征在于：外泌体保存液由0.3%（w/w）果胶和0.5%（w/w）海藻酸钠与磷酸盐缓冲液混合得到。4.根据权利要求1所述的提升外泌体稳定性的方法，其特征在于：将外泌体保存液...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，陆路，韩春乐，王淼，王娜，
申请(专利权)人：天津外泌体科技有限公司，
类型：发明
国别省市：