外泌体冻干保护剂和外泌体冻干制剂的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种外泌体冻干保护剂和外泌体冻干制剂的制备方法，涉及冻干技术领域。该外泌体冻干保护剂以10~50 mmol/L的Tris缓冲液为缓冲体系；按照各物质在所述缓冲体系中的工作浓度计，还包括糖类物质1~5%w/v、醇类物质1~5%w/v、明胶水解物0.1~0.5%w/v和精氨酸50~500 mmol/L。该外泌体冻干保护剂和外泌体冻干制剂的制备方法缓解了现有技术中存在的冻干保护剂无法有效的维持外泌体冻干后生物活性的技术问题。性的技术问题。性的技术问题。

【技术实现步骤摘要】
外泌体冻干保护剂和外泌体冻干制剂的制备方法


[0001]本专利技术涉及冻干
，尤其是涉及一种外泌体冻干保护剂和外泌体冻干制剂的制备方法。

技术介绍

[0002]外泌体是一类直径在50~150 nm，在生理或病理条件下，由细胞分泌的胞外囊泡。外泌体具有双层膜结构，主要成分包括蛋白质、RNA、DNA、氨基酸及各种代谢产物等。研究表明，外泌体中的核酸、蛋白质等成分具有传递遗传信息，调节生理功能等特性。不同来源的外泌体的功能不同，其中乳源外泌体作为乳汁重要成分之一，能够携带和传递miRNA等信号分子，已成为目前食源外泌体的研究热点。有研究对比分析了牛、猪、人和熊猫的乳源外泌体miRNA，发现乳源外泌体中富集的miRNA，都与增强免疫、调节代谢、抵抗疾病等事件相关。
[0003]随着外泌体应用的拓展，如何安全有效地保存外泌体变得非常重要。液态形式保存的外泌体保质期比较短，而且保存条件比较苛刻。一般
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80℃冷冻条件下只能保存半年左右，极大地限制了外泌体的应用。因此，如何方便地保存外泌体，且保持其生物活性及稳定性是亟待解决的问题。
[0004]目前已有文献公开采用冻干工艺将外泌体冻干成固体以保存外泌体，冻干过程中最重要的是冻干保护剂及缓冲体系的选择，同时冻干工艺的参数也将影响冻干效率及冻干后外泌体的完整性。已授权的专利中“一种人间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法、使用方法”（公开号为CN107245472A的中国专利申请，首次公开日期为2017年10月13日）的专利中采用单组分甘露醇作为保护剂，溶液为培养基；“一种制备人羊膜间充质干细胞外泌体冻干粉的方法”（公开号为CN104488850A的中国专利申请，首次公开日期为2015年04月08日）采用单组分的海藻糖作为外泌体的保护剂，缓冲液为PBS。其他在申请的专利中采用复合组分的保护剂如富血小板因子、普鲁兰、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、白蛋白、甘氨酸、甘油等成分，溶液为无菌水或者PBS缓冲液。在这些专利中采用的单一组分的冻干保护剂无法有效保证外泌体在冻干前后的完整性，已有的多组分冻干保护剂由于没有能够在冻干过程中抑制外泌体聚集成分，会导致外泌体在冻干后有大量的聚集体，同时已公开的专利或文章中所使用的缓冲液均为PBS，其组分中含有的磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的溶解度在低温条件下由有较大差异，导致在冻干过程中外泌体所处环境的pH有非常急剧的变化，最终导致外泌体的破损。
[0005]综上所述，目前外泌体冻干保护剂还无法满足实际的生产需要。
[0006]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一目的在于提供一种外泌体冻干保护剂，以缓解现有技术中存在的冻干保护剂无法有效的维持外泌体冻干后生物活性的技术问题。
[0008]本专利技术的第二目的在于提供一种外泌体冻干制剂的制备方法，该制方法利用上述
外泌体冻干保护剂对外泌体进行冻干保护。
[0009]为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：根据本专利技术的一个方面，提供了一种外泌体冻干保护剂，所述外泌体冻干保护剂以10~50 mmol/L的Tris缓冲液为缓冲体系；按照各物质在所述缓冲体系中的工作浓度计，还包括糖类物质1~5 %w/v、醇类物质1~5 %w/v、明胶水解物0.1~0.5 %w/v和精氨酸50~500 mmol/L。
[0010]优选地，所述糖类物质包括：海藻糖、蔗糖、聚蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、乳糖、棉子糖、果糖和麦芽糖中的一种或多种；和/或，所述醇类物质包括：甘露醇、丙三醇、乙二醇和聚乙二醇中的一种或多种。
[0011]优选地，所述外泌体冻干保护剂以10~50 mmol/L的Tris缓冲液为缓冲体系；按照各物质在所述缓冲体系中的工作浓度计，还包括海藻糖1~5 %w/v、甘露醇1~5% w/v、明胶水解物0.1~0.5 %w/v和精氨酸50~500 mmol/L。
[0012]优选地，所述外泌体冻干保护剂以20 mmol/L的Tris缓冲液为缓冲体系；按照各物质在缓冲体系中的工作浓度计，还包括海藻糖5 %w/v、甘露醇5 %w/v、明胶水解物0.1 %w/v和精氨酸100 mmol/L；或，所述外泌体冻干保护剂以20 mmol/L的Tris缓冲液为缓冲体系；按照各物质在缓冲体系中的工作浓度计，还包括海藻糖5 %w/v、甘露醇5 %w/v、明胶水解物0.5 %w/v和精氨酸400 mmol/L。
[0013]根据本专利技术的另一个方面，还提供了一种外泌体冻干制剂的制备方法，包括：冻干包含外泌体和上述外泌体冻干保护剂的混合体系。
[0014]优选地，冻干起始时，外泌体在冻干保护剂中的浓度为100~600 μg/mL。
[0015]优选地，所述冻干包括将所述混合体系依次进行冻干和干燥，所述冻干包括依次预冻、退火和冷冻；所述预冻为先
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8~
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12℃冻干30~60mim，再
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40~
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60℃冻干1~2 h；所述退火为
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15~
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25℃冻干0.5~2 h；所述冷冻为
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40~
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60℃冻干1.5~2.5 h。
[0016]优选地，所述预冻为先
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10℃冻干30 mim，再
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50℃冻干2 h；所述退火为
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20℃冻干1h；所述冷冻为
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50℃冻干2 h。
[0017]优选地，所述干燥包括依次一次干燥和二次干燥；所述一次干燥的条件为：温度
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20℃~
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30℃，时间15~20 h，真空度10~20pa；所述二次干燥的条件为：温度20℃~25℃，时间2~5 h，真空度5~10 Pa。
[0018]优选地，所述外泌体来源于乳。
[0019]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的外泌体冻干保护剂以Tris缓冲液作为缓冲体系，替代现有技术中的PBS缓冲液、注射水或培养基作为冻干保护剂基质，可以有效稳定外泌体在冻干过程中所处环境的pH，进而保护外泌体在冻干后的完整性和生物活性。本专利技术提供的冻干保护剂还添加了精氨酸和明胶水解物，可以在冻干过程中有效抑制外泌体的聚集，从而降低外泌体在冻干过程中由于聚集导致的对外泌体功效的破坏。
[0020]经实验验证，采用本专利技术提供的外泌体冻干保护剂对外泌体进行冻干保护，冻干
后外泌体粒径在大粒径区域分布显著减少，说明本专利技术提供的冻干保护剂可以有效的减少外泌体在冻干过程中的聚集；将冻干后的外泌体进行活性检测，相比于未采用本专利技术冻干保护剂的试验组，细胞样本的ColⅠ转录水平显著升高，说明本专利技术提供的外泌体冻干保护剂能够在冻干过程中有效保护外泌体的生物活性。
[0021]本专利技术提供的外泌体冻干制剂的制备方法，采用上述外泌体冻干保护剂对外泌体进行冻干保护，因此该制备方法也具有上述外泌体冻干保护剂的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体冻干保护剂，其特征在于，所述外泌体冻干保护剂以10~50 mmol/L的Tris缓冲液为缓冲体系；按照各物质在所述缓冲体系中的工作浓度计，还包括糖类物质1~5 %w/v、醇类物质1~5 %w/v、明胶水解物0.1~0.5 %w/v和精氨酸50~500 mmol/L。2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其特征在于，所述糖类物质包括：海藻糖、蔗糖、聚蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、乳糖、棉子糖、果糖和麦芽糖中的一种或多种；和/或，所述醇类物质包括：甘露醇、丙三醇、乙二醇和聚乙二醇中的一种或多种。3. 根据权利要求2所述的冻干保护剂，其特征在于，所述外泌体冻干保护剂以10~50 mmol/L的Tris缓冲液为缓冲体系；按照各物质在所述缓冲体系中的工作浓度计，还包括海藻糖1~5 %w/v、甘露醇1~5% w/v、明胶水解物0.1~0.5 %w/v和精氨酸50~500 mmol/L。4. 根据权利要求1
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3任一项所述的冻干保护剂，其特征在于，所述外泌体冻干保护剂以20 mmol/L的Tris缓冲液为缓冲体系；按照各物质在缓冲体系中的工作浓度计，还包括海藻糖5 %w/v、甘露醇5 %w/v、明胶水解物0.1 %w/v和精氨酸100 mmol/L；或，所述外泌体冻干保护剂以20 mmol/L的Tris缓冲液为缓冲体系；按照各物质在缓冲体系中的工作浓度计，还包括海藻糖5 %w/v、甘露醇5 %w/v、明胶水解物0.5 %w/v和精氨酸400 mmol/L。5.一种外泌体冻干制剂的制备方法，其特征在于，包括：冻干包含外泌体和权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，陆路，王淼，高梦雅，
申请(专利权)人：天津外泌体科技有限公司，
类型：发明
国别省市：