一种干细胞三维培养生物支架的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种干细胞三维培养生物支架的制备方法，该水凝胶为没食子酸修饰的羟丁基壳聚糖，具备良好的生物相容性和可降解性能。其具体实施过程如下：分离并培养来自人体的胎盘、脐带、牙髓、脂肪及成纤维组织等的干细胞以获得合格的干细胞来源，低温下将其均匀分散于所制备的温敏型壳聚糖水溶液中，在37℃形成温敏型壳聚糖水凝胶干细胞三维培养生物支架。在体外三维培养时可显著提高干细胞的增殖水平和生长状态，再现人体内细胞生长的真实立体微环境。注射到皮肤局部组织后，可显著提高移植干细胞在皮肤区域的保留时间和存活率，大大提高干细胞在体内可发挥的功能，进一步推进间充质干细胞细胞制剂的发展。间充质干细胞细胞制剂的发展。间充质干细胞细胞制剂的发展。

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞三维培养生物支架的制备方法
[0001]
：本专利技术涉及生物医药材料
，具体地说，涉及一种干细胞三维培养生物支架的制备方法。
[0002]
技术介绍
：人体的皮肤等组织可能伤口、组织切割或断裂以及烧伤而受损，并且皮肤老化是一个自然发生的过程，同时环境污染、紫外线照射、饮酒、吸烟和营养不良都会加剧皮肤老化，在影响美观的同时还会带来多种皮肤疾病，所以当前社会对于治疗皮肤损伤和逆转皮肤老化的需求量十分巨大。干细胞是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞，具有多向分化潜能、造血支持和自我复制能力，已经被临床应用于解决多种心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板损伤修复和自身免疫性疾病，挽救了许多病患的生命。
[0003]尽管将干细胞从实验室转移到临床使用是理论可行的，但在许多早期或晚期的临床实验中都出现了重大失败，导致大量的干细胞治疗产品不被批准，其主要失败因素包括但不限于干细胞在免疫相容性、稳定性、异质性、分化和迁移能力方面的质量控制不佳和特征不一致。当前干细胞培养最主要的方法仍是二维培养，仅支持干细胞在一个平面上生长，无法再现生物体内细胞真实的生长状况。二维培养环境下干细胞的生物活性、培养结构和营养物质的释放等很多方面均远不及三维培养，使原本的干细胞逐渐丧失其原有的性状、形态、结构和功能，导致其研究结果与体内试验结果经常不一致，实验参考价值和准确性较低。二维培养所提供的环境与生物体内微环境差距甚大，必然对干细胞的增殖分化产生负面作用，同时二维培养的低增殖效率也无法满足临床干细胞大剂量应用的需求。
[0004]除此之外，单纯的二维干细胞移植发挥的作用也极为有限，主要是由于移植的干细胞进入人体之后很快会发生大批量死亡。首先是细胞在移植过程中，由于从贴壁生长状态转变为悬浮状态，会启动一种名为失巢凋亡的细胞死亡途径；随后注射的干细胞会倾向于形成各种大小不一的团块，团块在形成血管之前扩散是唯一的营养来源，导致干细胞由于营养不足发生死亡；最后是植入部位的炎症环境对干细胞的杀伤导致其存活率进一步降低。
[0005]因此，研究人员一直在致力开发更为有效的体内外干细胞培养和使用方法。生物支架可以模拟体内细胞生长环境实现细胞与培养环境之间的相互作用，并有助于细胞黏附、增殖和分化，实现对干细胞的三维培养。在体外进行干细胞三维培养既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。当前用于干细胞培养的生物支架，如胶原海绵和脱细胞真皮基质，但是这种支架需要额外的细胞接种程序，不能很好地适应不同的移植部位情况。因此，具有溶胶
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凝胶转变特性且易于细胞包封和填充不规则的植入部位的水凝胶生物支架是用于干细胞三维培养的更好选择。
[0006]
技术实现思路
：本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种可显著提高干细胞的增殖水平和生长状态，能模拟人体内细胞生长真实立体微环境的干细胞三维培养生物支架的制备方
法。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种干细胞三维培养生物支架的制备方法，将人源干细胞悬液和温敏型壳聚糖溶液在0~4℃混合均匀，形成干细胞浓度为1
×
102~1
×
108cells/mL的温敏型壳聚糖水溶液，然后置于37℃的培养箱中，混合液迅速形成凝胶，形成干细胞三维培养生物支架。
[0008]作为优选的，在上述的制备方法中，所述人源干细胞来源于人体的胎盘、脐带、牙髓、脂肪或成纤维组织。
[0009]作为优选的，在上述的制备方法中，所述人源干细胞是指符合细胞库要求的第2~5代干细胞。
[0010]作为优选的，在上述的制备方法中，所述人源干细胞悬液的制备方法为：将人源干细胞用胰蛋白酶消化并离心，用高糖无血清DMEM培养基重悬细胞，轻轻吹打均匀制备成细胞悬液。
[0011]作为优选的，在上述的制备方法中，所述温敏型壳聚糖溶液的制备方法包括如下步骤：（1）将壳聚糖溶于质量分数1~10%盐酸溶液，加入1~5mol/L的NaOH溶液得沉淀，过滤得纯化的壳聚糖；（2）将步骤（1）所得纯化壳聚糖在质量分数50%NaOH溶液中碱化之后，加入1，2
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环氧丁烷在40
‑
50℃反应24
‑
48h，透析冻干后得到羟丁基壳聚糖（HBC）；（3）将步骤（2）所得羟丁基壳聚糖（HBC）与被1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺（EDC）和N
‑
羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化之后的没食子酸（GA）在50
‑
60℃反应24
‑
48h反应，透析冻干后得到羟丁基没食子酸壳聚糖（HBC
‑
GA）；（4）将步骤（3）所得羟丁基没食子酸壳聚糖（HBC
‑
GA）在0~4℃溶于超纯水水，配置成质量分数为1%
‑
5%的温敏型壳聚糖溶液。
[0012]作为优选的，在上述的制备方法中，所述干细胞浓度为1
×
103~1
×
108cells/mL。
[0013]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：（1）本专利技术的三维培养生物支架采用的温敏型壳聚糖水凝胶为羟丁基和多酚改性的壳聚糖，为天然高分子改性，具备更好的组织黏附能力和抗氧化能的同时生物相容性和生物降解性良好，在低温下水溶液呈流动可注射状态，温度升至体温附近时，即可形成水凝胶，并且具备可逆性温敏能力，该特性为医疗操作、细胞培养和组织工程提供了极大的便利。
[0014]（2）本专利技术制备的温敏型壳聚糖水凝胶干细胞三维培养生物支架可以模拟体内细胞生长环境，实现细胞与培养环境之间的相互作用，并有助于细胞黏附、增殖和分化，实现对干细胞的三维培养。在体外进行干细胞三维培养既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。
[0015]（3）本专利技术制备的温敏型壳聚糖水凝胶干细胞三维培养生物支架在注射到皮肤局部组织后，原位形成干细胞三维培养三维支架，可显著提高移植干细胞在机体内的的保留时间和存活率，大大提高干细胞在体内可发挥的功能，进一步推进干细胞细胞制剂的发展和在毛囊、牙髓、皮肤及机体各部位的靶向应用。
[0016]（4）本专利技术制备的温敏型壳聚糖水凝胶干细胞三维培养生物支架在毛囊、牙髓、皮
肤及机体各部位的靶向应用前景广阔，可用于机体各部位的器官修复或再生。
[0017]温敏型壳聚糖水凝胶干细胞三维培养生物支架在在包载干细胞后注射到体内中的应用。通过注射器均匀注射到体内使其通过温敏性原位形成干细胞三维培养生物支架，分析干细胞存活和保留情况。检测内容包括对细胞形态、细胞分化能力、细胞表明标志物和细胞表达因子的检测以及对温敏型壳聚糖水凝胶生物相容性和对细胞生长状态促进作用的研究。
[0018]附图说明：图1为温敏型羟丁基和没食子酸改性壳聚糖的制备过程图；图2为温敏型壳聚糖水凝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干细胞三维培养生物支架的制备方法，其特征在于：将人源干细胞悬液和温敏型壳聚糖溶液在0~4℃混合均匀，形成干细胞浓度为1
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108cells/mL的温敏型壳聚糖水溶液，然后置于37℃的培养箱中，混合液迅速形成凝胶，形成干细胞三维培养生物支架。2.根据权利要求1的所述的制备方法，其特征在于所述人源干细胞来源于人体的胎盘、脐带、牙髓、脂肪或成纤维组织。3.根据权利要求1的所述的制备方法，其特征在于所述人源干细胞是指符合细胞库要求的第2~5代干细胞。4.根据权利要求1的所述的制备方法，其特征在于所述人源干细胞悬液的制备方法为：将人源干细胞用胰蛋白酶消化并离心，用高糖无血清DMEM培养基重悬细胞，轻轻吹打均匀制备成细胞悬液。5.根据权利要求1的所述的制备方法，其特征在于所述温敏型壳聚糖溶液的制备方法包括如下步骤：（1）将壳聚糖溶于质量分数1~10%盐酸溶液，加入1~5mol/L的NaOH溶液得沉淀，过滤得纯化的壳聚糖；（2）将步骤（1）所得纯化壳聚糖在质量分数50%NaOH溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘杰，唐俊杰，伍震懿，
申请(专利权)人：依美时代深圳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：