一种分离纯化微囊藻毒素的方法技术

本发明专利技术涉及一种分离、纯化微囊藻毒素的方法，属于分析化学技术领域。产微囊藻毒素的蓝藻用１∶２０～８０的溶剂提取，提取液通过ＳＰＥ柱净化，然后利用恒流泵、Ｃ１８层析柱、自动部分收集器构成的柱层析系统对微囊藻毒素进行分离纯化，流动相由３５～５０％水、５０～６５％甲醇以及０．０５～０．１％酸组成。分离、纯化的微囊藻毒素ＲＲ（ＭＣ－ＲＲ）或微囊藻毒素－ＬＲ（ＭＣ－ＬＲ）经高效液相色谱分析，纯度达到９５％以上。其优点是：工艺简单、无需昂贵的仪器设备，运行、维护费用低，易于推广普及，其分离、纯化的微囊藻毒素的纯度已达到９５％的水平，满足开展蓝藻相关研究的要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种分离、纯{七微囊藻毒素的方法，属于分析化学

技术介绍
微囊藻毒素(Microcystins， MCs)是一类具有肝毒性的环肽毒素，是 淡水环境的水华中最常见的蓝藻毒素，主要由淡水蓝藻中的微囊藻 (Mcrocj)Ay他)、鱼腥藻"raZ "e"")、颤藻(Qyc/〃"tor/"或/V""A:to//7".Jc》、 念珠藻(7Vostoc)、项圈藻(^wa6(3ewo戸&)、陆生软管藻(//opa/asz^Aow) 等产生。水体中微囊藻毒素的存在已经导致世界范围内野生动物以及饲养 牲畜的死亡，近年来的研究显示微囊藻毒素对人类健康具有潜在威胁。微 囊藻毒素急性、慢性毒性促使人们对其检测方法、毒理学、饮用水中脱毒、 水生生物中的积累以及在环境中的迁移、降解等展开广^乏研究，所有这些 研究都需要纯化的微囊藻毒素。微囊藻毒素由7个氨基酸组成，分子量为800-1100Da，其结构特征是 具有一个被称为Adda的特殊的20碳(3-氨基酸，此外还含有3个D型氨 基酸一丙氨酸、赤-P-甲基天冬氨酸、谷氨酸、N-甲氧基脱氢丙氨酸和两个 可变的L-氨基酸。微囊藻毒素是根据2、 4号位上的两个可变L-氨基酸来 命名的，例如，最常见的MC-LR的可变氨基酸为亮氨酸(Leucine)和精 氨酸(Arginine)。迄今为止已有75种以上的微囊藻毒素被确认，在对动 物的毒性方面，其主要靶器官为肝脏。微囊藻毒素对哺乳动物的毒性很强，主要是强烈抑制两种蛋白磷酸酶(PP-1和PP-2A)的活性。近年来，随着我国湖泊、河流等富营养程度的加剧，蓝藻水华暴发愈 发频繁，其造成的危害已为全社会关注，有关微囊藻毒素的检测技术、毒理学以及降解等研究在国内广泛开展。2004年，中科院水生生物研究所的 肖定邦等申请了"一种微囊藻毒素分离纯化的方法"(CN200410012920.1), 以滇池蓝藻为原料以制备色谱和经典液液萃取为手段分离、纯化微囊藻毒 素MC-RR和[Dha，MC-RR。总的来看，微囊藻毒素只能从野外或室内培 养的蓝藻中分离、纯化，价格昂贵，目前主要依赖进口。有关利用野外产 毒蓝藻或室内培养产毒蓝藻分离、纯化制备微囊藻毒素的专利还不多，有 待进一步研究和开发。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于针对目前蓝藻研究中需要使用价格昂 贵的微囊藻毒素标准样品，提供一种分离、纯化J敫囊藻毒素的方法。技术方案本专利技术的目的是这样实现的 一种分离、纯化微囊藻毒素 的方法，其特征在于蓝藻中的微囊藻毒素经溶lflj提取，溶剂为体积比5 %的乙酸溶液，用量为蓝藻重量的20 80倍，通过SPE柱净化，SPE柱为 C18固相萃取柱，填料2 10g，体积12 60ml，利用柱层析系统分离、 纯化。所述的蓝藻为产微囊藻毒素-RR(MC-RR)或微囊藻毒素-LR(MC-LR) 的蓝藻，其来源为天然水体中的蓝藻，或在实验室内培养的蓝藻，其形态 为蓝藻冻干粉，或蓝藻粉，或鲜蓝藻。所述的微囊藻毒素为微囊藻毒素-RR (MC-RR)或微囊藻毒素-LR(MC-LR)。在本专利技术中所述的柱层析系统由层析柱、流动相、恒流泵、部分收集 器组成。其中层析柱，直452 4cm，长20 40 cm，填料为10 20pmC18 硅胶；流动相由水、甲醇和酸组成，三者体积比为35 50 : 50 65 : 0.05 0.1;流动相中的酸为甲酸，或三氟乙酸；流动木目的流速为2 10ml/min; 进样体积1 10ml。本专利技术所述的微囊藻毒素由自动部分收集器收集，利用高效液相色谱 方法对收集的微囊藻毒素部分进行纯度分析。将纯度大于95%的微囊藻毒 素部分在35'C水浴中氮气吹扫浓縮至一定体积或浓縮至干，在-20'C保存。有益效果本专利技术的优点在于工艺简单、无需昂贵的仪器设备，运 行、维护费用低，易于推广普及，其分离、纯化的微囊藻毒素的纯度已达 到95%的水平，满足开展蓝藻相关研究的要求。具体实施例方式实施例1步骤l:在50ml离心管中称取l.Og蓝藻粉(云南德林海生物科技有 限公司)，加入30ml5 %乙酸，在室温下超声波水浴(功率100w，频率 40KHz)超声30min， 10000 rpm离心15 min，倾出上清液。残渣加入30 ml5。/o乙酸，重复上述操作，合并两次上清液。步骤2:将SPE柱(5g/20ml，北京康林科技有限责任公司)依次用 50 ml甲醇、50 ml5Q/。乙酸平衡，然后将步骤1中的上清液通过SPE柱， 用50ml30。/o甲醇洗涤，用75ml含0.1。/。TFA (三氟乙酸)甲醇洗脱，洗 脱液在35 "C水浴旋转蒸发浓縮至近干，用2.5 m150 %甲醇溶解。步骤3:将流动相储罐(4 L，流动相由水、甲醇、三氟乙酸按 45 : 55 : 0.1组成)、恒流泵(DHL-B,上海青浦沪西仪器厂)、层析柱(直 径2cm，长30cm，填料20pmC18硅胶，上海厦美生化科技发展有限 公司)以及废液罐(2 L)连接，开启恒流泵使流动相按5 ml/min通过层 析柱，运纟于1小时。步骤4:将步骤2中SPE柱净化的2.5 ml溶液通过三通阀注入层析柱， 流速保持5ml/min。 45 min后将层析柱和自动部分收集器(BS-100A，上 海青浦沪西仪器厂)连接，开通自动部分收集器，每2min收集l管，收 集75管。步骤5:将步骤4收集的第25-50管中的微囊藻毒素-RR (MC-RR) 按国标GB20466-2006 "水体中微囊藻毒素的测定"进行分析。结果显示 34-36管中的MC-RR含量为5.1-8.3吗/ml，纯度均大于95 %。合并34-36 管收集的部分，在35 'C水浴用N2吹扫至干，用10ml色谱纯甲醇溶解， 经测定MC-RR含量为19.5吗/ml，在-20 。C条件下保存。 实施例2步骤l:室内培养的微囊藻FACHB905 (中国淡水藻种库购买)培养液(在 温度28'C、光照强度20001x、光暗比12: 12条件下于BG-11培养基中培养 20天，生物量1.56mg/ml) 500 ml， 15000 rpm离心30 min。收集藻细胞， 液氮反复冻融后，力口25ml5。/。乙酸，在室》显下超声波水浴(功率100w， 频率40KHz)中超声30min，在IOOOO rpm条4牛下离心15 min，倾出上清液。 残渣加入25ml5。/。乙酸，重复上述操作，合并两次上清液。步骤2:将SPE柱(5g/20ml，北京康林科技有限责任公司)依次用50 ml甲醇、50 ml5。/。乙酸平衡，然后将步骤1中的上清液通过SPE柱， 用50ml40。/。甲醇洗涤，用100ml含0.P/oTFA (三氟乙酸)甲醇洗脱，洗 脱液在35"C水浴旋转蒸发浓縮至近干，用5ml50。/。甲醇溶解。步骤3:将流动相储罐(4L，流动相由水、甲醇、甲酸按40:60:0.1 组成)、恒流泵(DHL-B，上海青浦沪西仪器厂)、层析柱(直径2 cm，长 40cm，填料20pmC18硅胶，上海厦美生化科技发展有限公司)以及废 液罐(2L)连接，开启恒流泵使流动相按6 ml/min通过层析柱，运行1 小时。步骤4:将步骤2收集的5ml净化液通过三通阀注入层析柱，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离纯化微囊藻毒素的方法，其特征在于：蓝藻中的微囊藻毒素经溶剂提取，溶剂为体积比５％的乙酸溶液，用量为蓝藻重量的２０～８０倍，通过ＳＰＥ柱净化，ＳＰＥ柱为Ｃ１８固相萃取柱，填料２～１０ｇ，体积１２～６０ｍｌ，利用柱层析系统分离、纯化。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：耿志明，王澎，刘蔼民，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]