本发明专利技术公开了一种产脂肽短小芽孢杆菌，其分类命名为短小芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）Ｙ８Ａ，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是ＣＣＴＣＣＭ ２０９１０８。本发明专利技术还公开了上述产脂肽短小芽孢杆菌在促进石油和／或功夫菊酯农药微生物降解过程中的应用。本发明专利技术的短小芽孢杆菌Ｙ８Ａ，能高效稳定的产生脂肽类生物表面活性剂，有效促进石油和／或功夫菊酯农药降解菌的生物降解过程。菌株Ｙ８Ａ本身的高效产脂肽功能可望作为新一代抗生素生产菌和促溶剂，广泛应用于农业、医药、化妆品和食品行业，与其它有机污染降解微生物一起可用于污染环境修复之中。该菌株能耐多种抗生素，发酵过程简单，操作容易。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于环境微生物工程领域，具体涉及一种产脂肽短小芽孢杆菌及其应用。
技术介绍
石油的开采、运输、储存以及事故性泄漏等原因造成每年约有上千万吨石油烃进入 环境，引起土壤、地下水、水系和海洋环境的严重污染，日益受到人们的关注。石油污 染物进入水体后，不仅使水体的化学需氧量升高，同时水表层的油膜又阻止了空气中的 氧向水中扩散，造成局部水域的厌氧状态，使水生动物因缺氧而死亡，水生植物的光合 作用也会遭到破坏，给生态系统带来严重危害。石油泄漏渗入土壤，当量超过土壤的自 净容量后，积累的油类物质将长期残留于其中，破坏土壤结构，影响土壤通透性，损害 植物根部，阻碍根的呼吸与吸收，对土壤植物和土壤微生物生态系统，甚至地下水都产 生危害，严重影响土壤生产力和农作物产量。治理石油污染己成为当今各国环境专家的 研究热点。98%以上的杀虫剂和95%以上的除草剂都没有作用到靶标生物上，而是到达了非靶 标生物、进入土壤、空气、水和食物之中，破坏生态系统，引起人和动植物急性或慢性 中毒。由于大多数农药(例如功夫菊酯等人工合成的拟除虫菊酯类杀虫剂)的水溶性 较差、在生物降解过程中与微生物的接触表面积小，使得生物修复过程较慢，这也是农 药生物降解周期长的一个主要因素。最近十年来， 一类新的由细菌非核糖体合成的脂肽类次生代谢物不断被发现和研 究。细菌脂肽为既亲水又亲脂的两性分子，是功能强大的表面活性剂，能极大地降低表 面张力与改变表面特性，因而在环境污染治理方面，特别是在石油和农药等难溶性污染 物生物修复方面具有极大的应用潜力。已经发现芽孢杆菌能产生三类脂肽类次生代谢 物表面活性素类(Surfactins)是由一个手性为LLDLLDL的七肽与一个p-羟基脂肪酸(脂 肪链长C13~ C15)通过内酯键形成的环状结构；伊枯草素类(Iturins)是由一个手性为 LDDLLDL的七肽和一个P-氨基脂肪酸(脂肪链长C14~ C17)①AA)形成的环状结构；丰 原素类(Fengycins )是由一个手性为LDDDLDLLLL的十肽和一个p-羟基脂肪酸(脂肪链 长C15 C17)通过内酯键形成环状结构。这三大类脂肽的手性和3D空间结构不同，性 能也有差异，这是为什么不同菌种间产生的生物表面活性剂强度有差异的重要原因，因 此筛选高效产脂肽菌株是一项十分重要的工作。细菌脂肽除了具有促进生物修复功能 外，还能抑制病原微生物生长，与人工合成的抗生素相比，具有副作用小、靶标活性高的特点，属于一类新型抗生素。此外，由于对人体无毒，也可作为食品和化妆品的添加 剂。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种高效产脂肽的短小芽孢杆菌，所产生的脂 肽能显著促进石油和/或功夫菊酯农药降解菌的生物降解过程。本专利技术还要解决的一个技术问题是提供上述短小芽孢杆菌在促进石油和/或功夫菊 酯农药降解菌的生物降解过程中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下本专利技术人从山东胜利油田石油污染土壤中分离、筛选得到并保藏的短小芽孢杆菌新菌株为Y8A，其分类命名为短小芽孢杆菌(5ad〃M/w脂7^)。目前该菌株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC);地址武 汉武汉大学；邮编430072;登记入册的编号CCTCC NO: M 209108;保藏日期 2009年5月18日。以此菌作为生产菌株。CCTCC NO: M 209108菌株具有下述性质1、形态特征短小芽孢杆菌Y8A为杆状，大小为L5~l.7nmx2.5~3.0pm，革兰氏阳性，能运动， 有侧生鞭毛，产芽孢。LB固体平板上3(TC培养48h，菌落呈淡黄色、圆形、不透明、 边缘不平整、表面扁平、湿润粗糙。 2、生理生化特征短小芽孢杆菌Y8A的生理生化特性见表1。表1菌株Y8A的生理生化特征<table>table see original document page 4</column></row><table>注"+":表示利用或呈阳性反应；即为阴性反应3、 16SrDNA序列分析测得短小芽孢杆菌Y8A的16S rDNA序列长度为1471 bp，具体见SEQ ID No.l所 示。将所测序列在RDP数据库比对分析，选取数据库中相关的16S rDNA序列，采用 Bioedit， MEGA3.1软件对Y8A进行系统发育分析，构建系统进化树。结果表明，菌株 Y8A与短小芽孢杆菌(5fl"7/^戶/w7"s)同源性达100%，再结合以上生理生化特性， 将Y8A鉴定为短小芽孢杆菌，具体为短小芽孢杆菌Y8A (CCTCCNO: M209108)。4、生物表面活性剂的特性(1) 生物表面活性剂的提取与定量分析提取获得的短小芽孢杆菌Y8A产的生物表面活性剂粗品为浅黄色粉末状。短小芽 孢杆菌Y8A生物表面活性剂的产量为5.05 g，L—1。(2) 表面活性剂的定性分析短小芽孢杆菌Y8A的生物表面活性剂粗品的薄层层析(TLC)检测在硅胶板上点 样不展层，产物经茚三酮显色剂显色后呈紫红色，初步判定菌株产生的是脂肽类生物表 面活性剂。短小芽孢杆菌Y8A产生的生物表面活性剂红外光谱检测在FT-IR谱图上， 3285-3295 cm"是由分子链间氢键引起的NH收縮振动谱带，3070~3075 cm"是NH基 团的分子内氢键引起的NH伸縮谱带，1650 1655 cm'1、 1534-1535 cm—1分别为酰胺谱带 I和II。这些特征吸收表明该表面活性剂分子含有肽链。谱图上2960~2870 cm"和 1455-1380 cm—1的两处吸收峰是来自脂肪族碳链的C—H伸缩振动，1225~1231 cm—1和 699 cm—i是内酯的特征吸收峰，表明该表面活性剂分子含有脂肪酸分子。因此，短小芽 孢杆菌Y8A产生的生物表面活性剂属脂肽类。(3) 发酵液乳化性能测定将发酵液与石蜡混合后，每隔12h检测乳化体积的变化，连续监测48h，菌株Y8A 的发酵液均能很好的乳化石蜡。Y8A发酵液在12h内，乳化体积维持在100%。随着时 间的延长，乳化体积有所下降，但下降速度非常缓慢，Y8A发酵液在48 h内乳化体积 仍保持在80%。放置7d后，乳化体积仍可达到70%。因此，短小芽孢杆菌Y8A发酵 液乳化性能稳定，增溶效果良好。(4) 临界胶束浓度(CMC)的测定 将提取到的表面活性剂粗品分别稀释至lOmg七-1， 20mg丄"，30mg'I/1， 40mg丄—1，50mg'U1， 100mg'U1， 200mg'L"后，测不同质量浓度的表面活性剂溶液的表面张力。 随着表面活性剂质量浓度的增大，溶液的表面张力逐渐降低，降到23.4mN-m—i后基本保 持不变，计算菌株所产生物表面活性剂的CMC值为30mg七—1，比一般化学表面活性剂 的CMC值(SDS2120mg丄'1，吐温20600 mg丄")低1 2个数量级，因此生物表面活性5剂比一般的化学表面活性剂在性能方面更优越。 5、发酵培养基及发酵条件的优化-(1) 菌体生长与发酵液表面张力的关系 菌株的生长量与发酵液表面张力呈反比，表面张力随着菌体生长而下降，菌体浓度达到最大时，表面张力达到最低，且在整个稳定期，发酵液的表面张力变化不大本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产脂肽短小芽孢杆菌，其分类命名为短小芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）Ｙ８Ａ，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ ２０９１０８。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈标，冉炜，曹娟，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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