本发明专利技术公开了一种猪血超氧化物歧化酶的规模化提取方法，是用新鲜猪血为原料生产超氧化物歧化酶，具体的工艺过程为，将猪血加入抗凝剂柠檬酸钠溶液后，以大容量连续分离机分离出红细胞、红细胞冷藏、搅拌匀浆、热变性、二级膜分离截流、柱层析、洗脱最后冷冻干燥得超氧化物歧化酶成品。工艺流程的特点，每一过程都采用能够连续化生产的分离技术，使整个生产过程能够规模化；工艺过程不使用有机溶剂，使环境污染降低到最低限度，副产品可进一步加工精深加工。得到的成品其比活力可达到３５００－１００００Ｕ／ｍｇ。本发明专利技术操作简单，猪血原料充足的地区适合于工业化规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工领域，特别是一种超氧化物歧化酶的提取方法。
技术介绍
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)简称SOD是广泛存在于好氧微生物和 动植物中的金属酶。目前在厌氧生物体内也发现SOD的存在。它催化超氧化物阴离子自由 基发生歧化反应，SOD是生物体内主要的氧自由基清除剂，可催化超氧阴离子自由基(02_) 发生歧化反应202-+2H+ — H202+02SOD在维持生物体内超氧阴离子自由基产生与消除的动态平衡中起重要作用，它 可以防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，还可以预防衰老，以及在一些疾病如肿瘤、炎 症和自身免疫的治疗中有良好的疗效，日前S0D已进入化妆品、食品和医药等领域。从猪血中制备S0D的方法比较多，与本专利技术相关的方法主要有(1)氯仿_乙醇沉 淀除去血红蛋白；(2)丙酮沉淀浓缩收集粗酶；(3) —次膜分离；(4)层析柱吸附洗脱等步 骤组成。此类方法存在下列缺陷第一，氯仿-乙醇沉淀除去血红蛋白，可以得到粗酶液，但 血红蛋白被严重污染，无法综合利用，造成资源浪费，同时有机溶剂成本较高，无形中增加 了生产的成本；第二，用丙酮沉淀浓缩可得粗酶液，但同时丙酮对酶的活力破坏比较大，会 使产品酶活力降低；每三，只用一次膜过滤截流无法对将蛋白质的分子量控制在一个较窄 的范围之内；第四，生产工艺复杂，周期较长，规模小，不能直接放大规模化生产，这是此类 技术最突出的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的就是要解决以上问题，提供一种猪血超氧化物歧化酶的规模化提取 方法，建立起一种规模化的猪血超氧化物歧化酶的最优化生产技术，尽可能少用或不用各 种有机溶剂，以减少有机溶剂对酶稳定性的破坏和带来的毒性，并且使工艺简单易操作，成 本低，生产处理量大，使猪血超氧化物歧化酶的生产技术达到工业化生产水平，使最后得到 的酶达到电泳纯。本专利技术的技术方案是这样得以实现的一种猪血超氧化物歧化酶的规模化提取方 法，其特点是将猪血加入抗凝剂柠檬酸钠溶液后，以大容量连续分离机_蝶式离心机分离 血浆和红细胞，红细胞可保存于4°C的冷库中，时间为5天以内；在红细胞中加入2倍体积 的重蒸水，搅拌勻浆；在勻浆液中加入2%的葡萄糖作为保护剂，60°C热变性20分钟；以分 子膜进行超滤，一级超滤截流分子量36000道尔顿，二级截流分子量30000道尔顿，并对二 级截流液进行浓缩；酶液经层析柱纯化，最后冷冻干燥得超氧化物歧化酶纯品。本专利技术的有益效果是第一，本规模化生产工艺没有使用有机溶剂，彻底革除乙醇 和氯仿等有机溶剂，简化工艺过程，降低生产成本；第二，对环境的污染很小，主要原因是没 有使用机溶剂；第二，副产品可进一步综合利用，如分离出来的血红蛋白没有受到污染，可 进一步利用，如果用有机溶剂分离血红蛋白，则没法进一步加工；第四，膜过滤时采用二次截流，可以减化生产工艺，同时工艺的连续操作性更强；第五，该工艺简单，处理量大，能够 在几小时内处理500Kg的猪血，并使生产周期仅为36小时；第六，机器的清洗难度小；第 七，生产过程紧凑，无太多浪费，成本低。生产的酶比活达到3500-10000U/mg。具体实施例方式实施例1取10Kg猪血，加入7%的柠檬酸钠溶液，用蝶式离心机连续分离得到红细胞，并用 10Kg的生理盐水洗涤后，加入20L重蒸水搅拌30分钟，在勻浆液中加入2%的葡萄糖作为 保护剂量，60°C热变性20分钟，滤液用超滤柱进行分离，一级超滤截流分子量36000道尔 顿，二级截流分子量30000道尔顿，将二级截流液浓缩，再经蛋白层析柱纯化后，用连苯三 酚检测法检测得酶的比活力为8600U/mg蛋白，透析脱盐后，进行冷冻干燥得成品。实施例2 取500Kg猪血，加入7 %的柠檬酸钠溶液，用蝶式离心机连续分离得到红细胞，并 用10Kg的生理盐水洗涤后，加入20L重蒸水搅拌30分钟，在勻浆液中加入2%的葡萄糖作 为保护剂量，60°C热变性20分钟，滤液用超滤柱进行分离，一级超滤截流分子量36000道尔 顿，二级截流分子量30000道尔顿，将二级截流液浓缩，再经蛋白层析柱纯化后，用连苯三 酚法检测得酶的比活力为7400U/mg蛋白，透析脱盐后，进行冷冻干燥得成品。权利要求一种，其特征在于将猪血加入抗凝剂柠檬酸钠溶液后，以大容量连续分离机-蝶式离心机分离血浆和红细胞，红细胞可保存于4℃的冷库中，时间为5天以内；在红细胞中加入2倍体积的重蒸水，搅拌匀浆；在匀浆液中加入2％的葡萄糖作为保护剂，60℃热变性20分钟；以分子膜进行超滤，一级超滤截流分子量36000道尔顿，二级截流分子量30000道尔顿，并对二级截流液进行浓缩；酶液经层析柱纯化，最后冷冻干燥得纯品。全文摘要本专利技术公开了一种，是用新鲜猪血为原料生产超氧化物歧化酶，具体的工艺过程为，将猪血加入抗凝剂柠檬酸钠溶液后，以大容量连续分离机分离出红细胞、红细胞冷藏、搅拌匀浆、热变性、二级膜分离截流、柱层析、洗脱最后冷冻干燥得超氧化物歧化酶成品。工艺流程的特点，每一过程都采用能够连续化生产的分离技术，使整个生产过程能够规模化；工艺过程不使用有机溶剂，使环境污染降低到最低限度，副产品可进一步加工精深加工。得到的成品其比活力可达到3500-10000U/mg。本专利技术操作简单，猪血原料充足的地区适合于工业化规模生产。文档编号C12N9/08GK101886062SQ20091002657公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月13日 优先权日2009年5月13日专利技术者李豪, 谷燕, 黄维 申请人:李豪;谷燕本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪血超氧化物歧化酶的规模化提取方法，其特征在于：将猪血加入抗凝剂柠檬酸钠溶液后，以大容量连续分离机－蝶式离心机分离血浆和红细胞，红细胞可保存于４℃的冷库中，时间为５天以内；在红细胞中加入２倍体积的重蒸水，搅拌匀浆；在匀浆液中加入２％的葡萄糖作为保护剂，６０℃热变性２０分钟；以分子膜进行超滤，一级超滤截流分子量３６０００道尔顿，二级截流分子量３００００道尔顿，并对二级截流液进行浓缩；酶液经层析柱纯化，最后冷冻干燥得纯品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李豪，谷燕，黄维，
申请(专利权)人：李豪，谷燕，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]
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