本发明专利技术涉及一种具有非随机失活状态Ｘ染色体及特定短串联重复序列的人胚胎干细胞系，其特征在于：所述胚胎干细胞系的平均群体倍增时间为约３２小时；所述胚胎干细胞系的未分化克隆ＡＫＰ检测为强阳性，具有较高的碱性磷酸酶活性；所述胚胎干细胞系能表达特异性表面抗原ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０和ＴＲＡ－１－８１，不表达表面抗原ＳＳＥＡ－１；所述胚胎干细胞系能表达Ｏｃｔ－４转录因子，保持未分化特性；所述胚胎干细胞系每隔１０代进行一次核型分析，具有正常核型，或者为易位型１３三体；所述胚胎干细胞系具有两条Ｘ染色体，Ｘ染色体失活分析显示其存在非随机失活特性；所述胚胎干细胞系具有独特的短串联重复序列。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及受精卵来源人胚胎干细胞，具体是涉及一种具有非随机失活状 态x染色体及特定短串联重复序列的人胚胎干细胞系。
技术介绍
人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell, hES)是由囊胚的内细胞 团(inner cell mass, ICM)分离培养而来的，具有全能分化特性的细胞，具有 自我更新和多向分化潜能，在细胞治疗、胚胎发育、药物筛选、基因治疗以及 遗传、表观遗传机制研究等领域具有很需要意义。人类胚胎干细胞研究始于 1998年，它已成为继人类基因组计划后生命科学中最活跃的研究领域。近年 来，胚胎干细胞的分离纯化、性能研究、培养扩增、诱导分化等有了突破性进 展。1998年，美国威斯康星大学Thomson实验室利用36枚临床治疗不孕夫 妇捐赠的新鲜或冷冻的囊胚，首次成功地分离、建立了 5株hES细胞系 (Thomson JA , ltskovitz Eldor J , Shapiro SS , et al . Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science ， 1998 ， 282 :1145-1147)。 2000年，澳大利亚Monash University和新加坡大学生殖中心的专家合作，成 功地从人囊胚建立了 2株未分化的hES细胞系(Reubinoff BE et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.Nat Biotechnol.2000 Apr;18(4):399-404.)。国内在2000年后，广州、 湖南、北京、上海等医学科研单位相继开始了胚胎干细胞的研究。2002年，中 山医科大学曾报道，他们使用5例人受精卵来源的囊胚初步建成了 3个胚胎 干细胞株(何志旭等。人胚胎干细胞系的初步建立.中华医学杂志，2002， 82: 1314)。 2004年，日本和英国的科学家也都得到了 hES细胞系(Suemori H et al. Establishment of human embryonic stem cell lines and their therapeuticapplication .Rinsho Byori, 2004, 52: 254 ;Stojkovic M et al. Derivation of human embryonic stem cells from day-8 blastocysts recovered after three-step in vitro culture.Stem Cells. 2004;22(5):790-7)。迄今国际上有美 国、英国、新加坡、澳大利亚、瑞典、日本、中国、韩国等20余个实验室建 有400株左右hES细亂公开发表的有关hES细胞建系的论著有300多篇(G uhr A,Kurtz A,et al.Current state of human embryonic stem cell research;an overview of cell lines and their use in experimental work .Stem Cells.2006 Oct;24(10):2187-91 )。讫今为止NIH登记的人ES细胞株超过60多株。hES细胞在体外合适条件下，可以保持未分化状态和无限增殖能力，也可 以定向诱导分化为几乎所有种类的细胞。由于干细胞具有以上特征，理论上可 以成为人类细胞或者器官移植的来源，为人类疾病的治疗带来了新希望。近10 年的发展，hES细胞培养技术日益成熟，为干细胞的临床的应用提供可能。利 用hES细胞修复或替代因各种因素所造成的人体组织器官缺损和功能障碍是 人类疾病治疗模式划时代的革新。用于细胞替代治疗的hES细胞必须具备安全 性、有效性、免疫豁免性三大特点,因而国内外很多研究集中于以下课题(1) 纯化hES细胞培养环境，避免动物源性物质的污染；(2) hES细胞诱导分化为 各种成体细胞及其前体细胞以及移植；(3)体细胞核移植与ntES细胞系的建 立；(4)人孤雌胚胎干细胞系的建立；(5) hES细胞的表观遗传学变化，如印 记基因及甲基化水平、X染色体失活的检测等；(6) hES细胞与基因治疗。我国人类胚胎干细胞(hES)建系的来源与培养方法主要有以下几种 (一)、hES系的主要来源为体外受精囊胚，细胞核移植胚胎及早期发育 的桑椹胚和人孤雌胚胎分离培养的hES系。囊胚法囊胚内细胞团(Inner cell m ass, ICM)是分离hES的最常用材料。将人 工受精的胚胎或正常体内受精的胚胎培养至囊胚，分离培养出ICM，进一步分 离培养增殖的ICM,得到hES细胞集落，传代增殖并检测后即得到hES细胞 系。目前所建立的hES系基本上都是由人工体外受精培养至囊胚期的ICM分 离培养得至U ( Baharvand H， A sh tiani S K， V alo jerdiM R, et al. Establishment and in v itro differentiation of a new embryonic stem cell linefrom human blastocyst D ifferentiation, 2004, 72 (5) :224-229.; V erlinsky Y, Strelchenko N , Kukharenko V ， et al. Human embryonic stem cell lines w ith genetic diso rders Rep rod Biomed Online, 2005， 10 (1): 105-110.)。其具体技术路线为囊胚一脱透明带(Tyrode酸或链蛋白酶 或机械法)一去滋养层细胞(免疫外科法或酶消化法)一纯化的ICM —适宜 的饲养层上扩增ICM —离散增殖的ICM为小细胞团块一重新接种在饲养层上 培养一离散hES细胞集落为小细胞团块一接种在饲养层上传代培养一出现多 个hES样集落一在饲养层上或无饲养层扩大培养一鉴定一建立hES系。ICM 的分离是一大难点。分离ICM的方法主要有免疫外科法和机械法两种。目前 大多数hES细胞系都是采用免疫外科方法，用特殊的抗体，例如BeWO细胞 的单克隆抗体，抗人的全血清，或者红细胞抗体从囊胚中分离出ICM细胞。 这些抗体与滋养层细胞表面的主要组织相容性抗原(major histocompatibility complex, MHC)结合形成免疫复合物，在补体存在时可导致滋养层细胞发生免 疫溶解，从而得到ICM细胞。但免疫外科法存在动物源性污染问题，在很大 程度上存在传播动物疫病和产生异种免疫排斥的风险。尽量减少动物源性污 染，改善胚胎干细胞的体外培养条件，建立更有效更简便的获得胚胎干细胞的 方法已成为现今各国研究的重点。(二)、建立和维持hES系的条件 饲养层饲养层是建立和维持ES细胞系的必要条件。大部分已分离得到的人hES 细本文档来自技高网...
【技术保护点】
具有非随机失活状态Ｘ染色体及特定短串联重复序列的人胚胎干细胞系，其特征在于： （ａ）所述胚胎干细胞系的平均群体倍增时间为约３２小时； （ｂ）所述胚胎干细胞系的未分化克隆碱性磷酸酶即ＡＫＰ检测为强阳性，具有较高的碱性磷酸酶活性； （ｃ）所述胚胎干细胞系能表达以下特异性表面抗原之一：阶段特异性抗原－３即ＳＳＥＡ－３，阶段特异性抗原－４即ＳＳＥＡ－４，肿瘤反应抗原－１－６０即ＴＲＡ－１－６０，以及肿瘤反应抗原－１－８１即ＴＲＡ－１－８１，而不表达阶段特异性抗原－１ 即ＳＳＥＡ－１； （ｄ）所述胚胎干细胞系能表达八聚体结合转录因子４即Ｏｃｔ－４转录因子，保持未分化特性； （ｅ）所述胚胎干细胞系每隔１０代进行一次核型分析，具有正常核型，或者为易位型１３三体； （ｆ）所述胚胎干细胞系具有两 条Ｘ染色体，Ｘ染色体失活分析显示其存在非随机失活特性； （ｇ）所述胚胎干细胞系具有独特的短串联重复序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙筱放，
申请(专利权)人：广州医学院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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