HLA-DQB1基因分型DNA微阵列芯片试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及ＤＮＡ微阵列芯片检测试剂盒，该试剂盒能够高通量、高效率、高特异性对人类白细胞抗原ＤＱＢ１（ＨＬＡ－ＤＱＢ１）基因进行分型检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及DNA微阵列芯片试剂盒，该试剂盒能够高通量、高效率、高特异性对人类白细胞抗原DQB1 (HLA-DQB1)基因进行分型 检测。
技术介绍
HLA(Human leukocyte antigen,人类白细胞抗原)是人类主要组织相容性系统。组织相容性 是指不同个体间进行组织或器官移植时，供者和受者双方接受的程度。供受者组织不相容引 起的反应，被证实是一种免疫反应，它是由细胞表面同种异型抗原诱导的，这个代表个体特 异性的抗原称移植抗原或组织相容性抗原，其中起主要作用的抗原称主要组织相容性系统 (MHS)， HLA (人类白细胞抗原)就是人类的主要组织相容性系统。HLA基因复合体位于人 类第6号染色体6p21.3区域，具有高度单核苷酸多态性(SNPs)。 HLA存在多个基因座位， 每个基因座位有可以分为多种型别、亚型和等位基因。HLA的生物学和医学意义包括免疫学反应、器官移植排除反应和疾病关联性等等。在疾 病关联性方面，研究发现HLA-DQB1的某些亚型与多种疾病存在密切的关联性， HLA-DQB1*0602的基因频率在Graves病合并2型糖尿病患者组中较健康对照组明显增加， 有很强的相关性，是Graves病合并2型糖尿病患者的易感基因；DQBl*020x等位基因频率 在I型银屑病患者中显著增高，DQBP020x等位基因与银屑病的家族遗传史及早发型银屑病 相关；DQBP03032和DQBP0602型儿童，幽门螺杆菌感染发展为慢性胃炎概率显著低于其 它基因型别，提示遗传保护因素的作用；DQBP0602基因为中国发作性睡病人群的易感基因， DQB"0401-0402基因为中国发作性睡病人群的保护基因，等等。HLA-DQB1基因分型方法是从90年代开始发展起来的，目前主要包括PCR-SSP (PCR-序列特异性引物法)、PCR-SSOP (PCR-序列特异性寡核苷酸探针法)、SBT (测序法)、FCM (流式法)方法。这些方法目前被西方国家的少数企业垄断，我国处于空白状态，完全依赖 进口。同时，这些方法也存在一些技术问题，比如引物过多造成检测错误、探针杂交单一温 度造成特异性降低、检测通量过小等等。DNA微阵列法是近几年发展起来的新型基因分型法，相比其它分型方法，具有高通量、 集约化、低成本、高准确性等特点，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于该技 术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分 析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量 等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的 应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序 (Sequencing by hybridization, SBH)等，为"后基因组计划"时期基因功能研究及现代医学科 学、医学诊断学的发展提供了强有力的工具。本专利技术解决了我国目前HLA-DQB"分型检测试剂依赖进口以及目前检测方法上的弊端， 具有技术和价格双重优势，实际应用以后会产生经济和社会双重效益。
技术实现思路
本专利技术的目的是将DNA微阵列技术应用于HLA-DRQ1基因座位的基因分型检测，开发 了一种新型的基因分型检测试剂盒。本专利技术所采用的技术方案是针对HLA-DRQ1座位的第二外显子，设计一套特异性寡核 苷酸探针(表l)，采用自动点样机器人，将探针印制在一张玻片的特定区域，每张玻片印制 IO个微阵列矩阵，这样就制成DNA微阵列芯片， 一张芯片可以检测IO个样本，再配以其它 必要的组份，如PCR引物(表2)，组成完整的试剂盒。实际检测时，取10份人基因组DNA 溶液，采用CY3标记引物和不对称PCR方法，扩增出人基因组HLA-DRQ1基因的第二外显 子单链CY3标记片段。取DNA微阵列芯片一张，在10个杂交区分别加入10种PCR产物 2ul和杂交液8ul。将芯片放在自动杂交洗涤仪的杂交槽内，杂交温度设定为52'C，杂交时间 30分钟，自动洗涤吹干。取出玻片，放入GenePix4100A扫描仪进行扫描，使用分析软件对 扫描图像信号进行图像数据转换处理，经过分析产生样本基因型别结果。本试剂盒采用DNA微阵列技术，可以大大提高检测通量，每张玻片可以制备用于检测 10个样本的DNA微阵列，是现有一般检测技术的10倍以上。本专利技术可用于HLA-DQB1基 因分型检测以及相关联疾病的筛査和辅助诊断。表1寡核苷酸探针序列名称序列(5' -3')碱基数QlAACGGGACAGAGCGCGT17Q2GCGTGCGGGGTGTGAC17Q3TGCGTCTTGTAACCAGA17Q4GCGTGCGTCTTGTGAGC17Q5GCGTGCGTTATGTGACC175Q6GAGTACGCACGCTTCGA17Q7GAGTACGCGCGCTTCGAC17Q8TGTACCGCGCGGTGACG17Q9CGGTGACGCCGCTGGGG17Q10CGGCCTGACGCCGAGTA17QllCGGCCTAGCGCCGAGTA17Q12CTGCCTGCCGCCGAGTA17Q13CGGCCTGATCCCGAGTA17Q14GGTGGCGTTCCGCGGGA17Q15CGAGGTGGGGTACCGCG17Q16CGGGACCGAGCTCGTGC17Q17CGGGACCGAGCGCGTGC17Q18CGGGCGGAGTTGGACAC17QNGCTTCGACAGCGACGTG17QPGCTTCGCCATCGACGTG17QN, QP分别为阴性和阳性控制探针表2引物序列名称序列(5' -3')碱基数PlGGGCCTGTGCTACTTCACCAA21P2-lTCTCCTCTGCAGGATCCCGCG21P2-2TCGCCGCTGCAAGGTCGTGCG21以下结合附图说明本专利技术的具体实施。 附图说明图1 HLA-DQB1基因分型DNA微阵列杂交区和探针微阵列示意图1芯片整体外观2杂交区以及探针微阵列 具体实施例方式本专利技术用下列实施例进行解释，目的只是为了解释而不是以任何方式限制本专利技术。实施例一方法1: HLA-DQB1基因分型DNA微阵列PCR引物和寡核苷酸探针的设计和合成6为了采用特异性PCR扩增HLA-DQB1基因座位的第2外显子，分别在第2外显子两端 设计特异性5'引物P1和3'引物P2-1， P2-l， P2-l， P2-1用CY3荧光标记。引物序列见表 2。针对HLA-DQB1第2外显子基因序列的多态性，设计18种分型探针，见表1。 方法2: HLA-DRQ1基因分型DNA微阵列的制备采用基因芯片自动点样仪，将18种分型探针和两种对照探针点制到玻片的特定区域，制 成DNA微阵列。(1) 点样探针溶液将探针稀释到5XSSC、 0.05。/。SDS溶液中，终浓度为30uM;(2) 点样矩阵(如图1)将探针点制在玻片上，每个探针横向重复3点点制在杂交区 内；杂交区分成10个。实施例一采用HLA-DQB1基因分型用DNA微阵列芯片检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ微阵列芯片检测试剂盒，用于对ＨＬＡ－ＤＱＢ１基因进行分型检测，该试剂盒将１８种寡核苷酸探针，点制在玻片上，制成ＤＮＡ微阵列芯片，配以３种引物以及其它组分，其特征在于所用的寡核苷酸探针序列分别为：　Ｑ１：５’－ＡＡＣＧＧＧＡＣ ＡＧＡＧＣＧＣＧＴ－３’　Ｑ２：５’－ＧＣＧＴＧＣＧＧＧＧＴＧＴＧＡＣ－３’　Ｑ３：５’－ＴＧＣＧＴＣＴＴＧＴＡＡＣＣＡＧＡ－３’　Ｑ４：５’－ＧＣＧＴＧＣＧＴＣＴＴＧＴＧＡＧＣ－３’　Ｑ５：５’－Ｇ ＣＧＴＧＣＧＴＴＡＴＧＴＧＡＣＣ－３’　Ｑ６：５’－ＧＡＧＴＡＣＧＣＡＣＧＣＴＴＣＧＡ－３’　Ｑ７：５’－ＧＡＧＴＡＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣ－３’　Ｑ８：５’－ＴＧＴＡＣＣＧＣＧＣＧＧＴＧＡＣＧ－３’　 　Ｑ９：５’－ＣＧＧＴＧＡＣＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧ－３’　Ｑ１０：５’－ＣＧＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＧＡＧＴＡ－３’　Ｑ１１：５’－ＣＧＧＣＣＴＡＧＣＧＣＣＧＡＧＴＡ－３’　Ｑ１２：５’－ＣＴＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧ ＡＧＴＡ－３’　Ｑ１３：５’－ＣＧＧＣＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＧＴＡ－３’　Ｑ１４：５’－ＧＧＴＧＧＣＧＴＴＣＣＧＣＧＧＧＡ－３’　Ｑ１５：５’－ＣＧＡＧＧＴＧＧＧＧＴＡＣＣＧＣＧ－３’　Ｑ１６：５’－Ｃ ＧＧＧＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＣ－３’　Ｑ１７：５’－ＣＧＧＧＡＣＣＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣ－３’　Ｑ１８：５’－ＣＧＧＧＣＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣ－３’。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡守旺，张帆，李明，程钢，何蕴韶，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，广州达泰生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]