HLA-C基因分型DNA微阵列芯片试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及ＤＮＡ微阵列芯片试剂盒，该试剂盒能够高通量、高效率、高特异性对人类白细胞抗原Ｃ（ＨＬＡ－Ｃ）基因进行分型检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及DNA微阵列芯片试剂盒，该试剂盒能够高通量、高效率、高特异性对HLA-C基因进行分型检测。
技术介绍
HLA(Human leukocyte antigen,人类白细胞抗原)是人类主要组织相容性系统。组织相容性 是指不同个体间进行组织或器官移植时，供者和受者双方接受的程度。供受者组织不相容引 起的反应，被证实是一种免疫反应，它是由细胞表面同种异型抗原诱导的，这个代表个体特 异性的抗原称移植抗原或组织相容性抗原，其中起主要作用的抗原称主要组织相容性系统 (MHS)， HLA (人类白细胞抗原)就是人类的主要组织相容性系统。HLA基因复合体位于人 类第6号染色体6p21J区域，具有高度单核苷酸多态性(SNPs)。 HLA存在多个基因座位， 其中HLA-C座位是影响移植排斥反应的座位之一。SNPs是决定组织相容性的本质因素，个 体之间的SNPs差异程度决定着相容性程度。HLA-C基因座位的SNPs主要集中在第二、三 外显子上。根据SNPs的差异特点，可以进行基因分型，将HLA-C基因座位分成不同的型别 和亚型，型别和亚型相同者，SNPs差异较小，相容性好，反之亦然。HLA基因分型技术广 泛应用于造血干细胞移植、器官移植、疾病关联研究。HLA-C基因分型方法是从90年代开始发展起来的，目前主要包括PCR-SSP (PCR-序列 特异性引物法)、PCR-SSOP (PCR-序列特异性寡核苷酸探针法)、SBT (测序法)、FCM (流 式法)方法。这些方法目前被西方国家的少数企业垄断，我国处于空白状态，完全依赖进口。 同时，这些方法也存在一些技术问题，比如引物过多造成检测错误、检测通量过小等等。DNA微阵列法是近几年发展起来的新型基因分型法，相比其它分型方法，具有高通量、 集约化、低成本、高准确性等特点，是融微电子学、牛物学、物理学、化学、计算机科学为 一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于该技 术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分 析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量 等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的 应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序 (Sequencing by hybridization, SBH)等，为"后基因组计划"时期基因功能研究及现代医学科4学、医学诊断学的发展提供了强有力的工具。
技术实现思路
本专利技术的目的是将DNA微阵列技术应用于HLA-C基因分型检测，开发了一种新型的基 因分型检测试剂盒。本专利技术所采用的技术方案是针对HLA-C基因座位的第二、三外显子，设计一套特异性 寡核苷酸探针(表1)，采用自动点样机器人，将探针印制在玻片的特定区域，制成高密度 DNA微阵列(芯片分为10个检测区，可以检测同时检测IO个样本)，再配以其它必要的组 份，包括PCR引物(表2)组成完整的试剂盒。实际检测时，取10份人基因组DNA溶液， 采用CY3标记引物和不对称PCR方法，扩增出人基因组HLA-C基因的第二、三外显子单链 CY3标记片段。取DNA微阵列芯片一张，分别加入10种PCR产物2ul和杂交液8ul。将芯 片放在自动杂交洗涤仪内，设定杂交温度52t:，杂交时间30分钟，自动洗涤吹干。取出芯 片，砍入GenePix 41Q0A.扫描仪进行扫描，使用分析软件对扫描图像信号进行图像数据转换 处理，并分析产生样本基因型别结果。本试剂盒采用高密度DNA微阵列技术，可以大大提高检测通量，每张芯片可以制备用 于检测IO个样本的DNA微阵列，是现有一般检测技术的IO倍以上；同时，由于采用了国 产原材料，与同类进口产品相比成本得到显著降低。本专利技术的试剂盒用于用于临床移植配型和造血干细胞库建立HLA-C基因分型检测。表l HLA-C基因分型寡核苷酸探针名称序列(5' -3')碱基数ClGCGAGTCCAAGAGGGGA17C2CGTGCAGTTCGACAGCG17C3GCCGCGGGAGCCGTGGG17C4GGGGAGCCCCGGGCGCC17C5ACACAGAACTACMGCG17C6CCGAGTGMCCTGCGGA17C7CTGCGGAAACTGCGCGG17C8AGGCACAGGCTGACCGA17C9AACCAGAGCGAGGACG16C10CCTCCAGAGGATGTTTG17CllTCTCACATCATCCAGAG17C12CCTCCAGAGGATGTACG175C13GCTGCGACGTGGGGCCC17C14CTGGGGCCGGACGGGCG17C15TGACCAGTCCGCCTACG17C16TGACCAGTTAGCCTACG17C17AACGAGGATCTGCGCTC17C18GCGGACACGGCGGCTCA17C19GCGGACMGGCGGCTCA17C20GGCCCGTGCGGCGGAGC17C21GCGCAAGTTGGAGGCGG17C22GCCCTGAATGAGGACCT17CNGAGTATTC GGATCGGGA17'CP..GAGTATTGGGACCGGGA.17CN, CP分别为阴性和阳性控制探针表2引物序列名称 序列(5' -3') 碱基数 特异性PIAGTGGGCTACGTGGACGACAC21特异性扩增HLA-C第2外显子P2CGCTTGTACTTCTGTGTCTCC21P3GACGGGCGCCTCCTCCGCGGG21特异性扩增HLA-C第3外显子P4CTGCGGAGCCACTCCACGCAC21本专利技术用下列实施例进行解释，目的只是为了解释而不是以任何方式限制本专利技术。 以下结合附图说明本专利技术的具体实施。附图说明图1 HLA-C基因分型DNA微阵列杂交区和探针微阵列示意图1、 2芯片外观3杂交区及探针矩阵 具体实施例方式实施例一方法1: HLA-C基因分型DNA微阵列PCR引物和寡核苷酸探针的设计和合成为了采用特异性PCR扩增HLA-C基因座位的第2、 3外显子，分別在第2外显子的始端和末端设计特异性引物P1、 P2，以及在第3外显子开始和末端设计引物P3、 P4。合成、CY3标记、纯化。引物序列见表2。针对HLA-C基因第2、 3外显子基因序列的多态性，设计22种分型探针，序列见表1，合成、修饰、纯化。方法2: HLA-C基因分型DNA微阵列的制备采用基因芯片自动点样仪，将22种分型探针和两种对照探针点制到玻片的特定区域，制成DNA微阵列。(1) 点样探针溶液-将探针稀释到5XSSC、 0.05y。SDS溶液中，终浓度为30uM;(2) 点样矩阵(如图1)将探针点制在玻片上，每个探针横向重复3点点制在杂交区内；杂交区分成10个。实施例二采用HLA-C基因分型用DNA微阵列检测临床样本HLA-C基因型别'取IO份己知基因型别的DNA样本，采用CY3标记的PCR引物，上下游引物1:30 (分子数比)不对称PCR方法，PCR循环参数为94°C 5，； 94°C 30",58。C 30",72。C 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ微阵列芯片检测试剂盒，用于对ＨＬＡ－Ｃ基因进行分型检测，该试剂盒将２２种寡核苷酸探针，点制在玻片上，制成ＤＮＡ微阵列芯片，配以４种引物以及其它组分，其特征在于２２种寡核苷酸探针的序列分别为：　Ｃ１：５’－ＧＣＧＡＧＴＣＣＡＡ ＧＡＧＧＧＧＡ－３’　Ｃ２：５’－ＣＧＴＧＣＡＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＧ－３’　Ｃ３：５’－ＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＣＣＧＴＧＧＧ－３’　Ｃ４：５’－ＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣ－３’　Ｃ５：５’－ＡＣ ＡＣＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＧ－３’　Ｃ６：５’－ＣＣＧＡＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡ－３’　Ｃ７：５’－ＣＴＧＣＧＧＡＡＡＣＴＧＣＧＣＧＧ－３’　Ｃ８：５’－ＡＧＧＣＡＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡ－３’　 Ｃ９：５’－ＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧ－３’　Ｃ１０：５’－ＣＣＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧ－３’　Ｃ１１：５’－ＴＣＴＣＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＡＧ－３’　Ｃ１２：５’－ＣＣＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＡＣ Ｇ－３’　Ｃ１３：５’－ＧＣＴＧＣＧＡＣＧＴＧＧＧＧＣＣＣ－３’　Ｃ１４：５’－ＣＴＧＧＧＧＣＣＧＧＡＣＧＧＧＣＧ－３’　Ｃ１５：５’－ＴＧＡＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＣＧ－３’　Ｃ１６：５’－ＴＧＡＣ ＣＡＧＴＴＡＧＣＣＴＡＣＧ－３’　Ｃ１７：５’－ＡＡＣＧＡＧＧＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣ－３’　Ｃ１８：５’－ＧＣＧＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＡ－３’　Ｃ１９：５’－ＧＣＧＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＴＣＡ－３’　 　Ｃ２０：５’－ＧＧＣＣＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣ－３’　Ｃ２１：５’－ＧＣＧＣＡＡＧＴＴＧＧＡＧＧＣＧＧ－３’　Ｃ２２：５’－ＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＧＧＡＣＣＴ－３’　。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡守旺，张帆，李明，程钢，何蕴韶，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，广州达泰生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]