一种用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌及其构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明专利技术通过基因工程的手段对E.coli Nissle1917(EcN 1917)菌株进行改造，筛选不同启动子条件下精氨酸酶的表达情况，构建出能够有效表达精氨酸酶的大肠杆菌工程益生菌。该益生菌可定殖在肠道中并降解肠道被消化食物中的精氨酸，动物实验证实精氨酸酶缺乏症小鼠口服该菌株后血液中精氨酸浓度显著降低，因此有潜力开发成用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌，具有重要的临床治疗价值和社会效益。具有重要的临床治疗价值和社会效益。具有重要的临床治疗价值和社会效益。

【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]精氨酸酶缺乏症(Argininemia，ARG)是一种罕见的常染色体隐性遗传病。精氨酸酶1(Arginase
‑
1，ARG1)在肝细胞中表达量最高，能够催化精氨酸水解为鸟氨酸和尿素，后者在血液中被运输到肾脏并在尿液中排出，而鸟氨酸被循环利用以继续进行进一步的尿素生产。ARG1编码基因的位点突变导致ARG1功能的部分或全部丧失，血液及脑脊液中精氨酸及其代谢产物累积。ARG1缺陷患者表现出高精氨酸血症，伴有痉挛性下肢轻瘫、进行性神经和智力障碍、持续性生长迟缓和罕见的高氨血症。
[0004]目前针对ARG患者的临床疗法分别为：(1)限制天然蛋白质的摄取，采取低精氨酸的饮食策略；(2)药物治疗包括苯甲酸钠、苯丁酸钠及卡谷氨酸等口服药物，主要作用为促进氨的排泄，控制高氨血症；(3)酶替代疗法，利用聚乙二醇精氨酸酶，促进精氨酸代谢，降低血液中精氨酸的含量；(4)肝移植，即对患者进行肝移植手术治疗，显著提高精氨酸水平。此疗法是目前最具针对性及有效的治疗方法；(5)对症治疗，根据患者的症状针对性的进行物理或药物治疗。
[0005]益生菌是定殖在人体内，通过调节肠道内菌群或调节宿主免疫系统功能，从而产生有利于健康作用的活性微生物。大肠杆菌属Escherichia coli Nissle 1917(EcN 1917)是目前广泛应用的一种益生菌，可长期稳定的定殖在人体肠道中。与常规的大肠杆菌相比，EcN可用于治疗炎症性肠病，防止新生儿消化道内病原菌定殖以及免疫调节作用等。目前已有研究将EcN菌株进行基因改造用于小鼠模型中苯丙酮尿症(PKU)、免疫源性疾病等的治疗中。
[0006]研究表明人体内存在着氨基酸肠道循环系统，即进入肠道的胰腺及其他腺体分泌物中包含大量的蛋白质、酶和多肽，胰蛋白酶可将上述物质分解成氨基酸后通过肠道重新吸收回体内，这在身体其他部位和肠道之间形成一个大的氨基酸循环系统。根据氨基酸肠道循环理论，可通过减少肠道中的特定氨基酸的含量从而降低体内氨基酸的含量。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供一种用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌及其构建方法和应用。本专利技术通过基因工程的手段对E.coli Nissle 1917(EcN 1917)菌株进行改造，筛选不同乏氧启动子条件下精氨酸酶的表达情况，构建出能够有效表达精氨酸酶的大肠杆菌工程益生
菌。该益生菌可定殖在肠道中并降解肠道被消化食物中的精氨酸，动物实验证实精氨酸酶缺乏症小鼠口服该菌株后血液中精氨酸浓度显著降低，因此有潜力开发成用于治疗精氨酸酶缺乏症的工程益生菌。
[0008]为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0009]本专利技术的第一个方面，提供一种工程益生菌，其为大肠杆菌衍生菌，在基因组上整合厌氧启动子和外源精氨酸酶编码基因。
[0010]其中，所述大肠杆菌衍生菌具体为大肠杆菌EcN 1917的衍生菌；
[0011]其中，所述外源精氨酸酶编码基因具体为argI，来源于Bacillus subtilis168菌株，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]所述厌氧型启动子，其可以选自如下任意一种：
[0013]厌氧型启动子P
fnrS
，来源于E.coli菌rRNA FnrS编码基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]厌氧型启动子P
nirB
，来源于E.coli菌亚硝酸还原酶编码基因nirB的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0015]厌氧型启动子P
adhE
，来源于E.coli菌乙醇脱氢酶编码基因adhE的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0016]厌氧型启动子P
vgb
，来源于Vitreoscilla菌血红蛋白编码基因vgb的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0017]本专利技术经研发意外发现，不同来源启动子对精氨酸酶的表达情况影响甚大，其中厌氧型启动子P
fnrS
与精氨酸酶编码基因argI配合最终获得的工程益生菌(在本专利技术中命名为EcN AR11)其具有最佳的降解精氨酸能力。
[0018]本专利技术的第二个方面，提供上述工程益生菌的构建方法，所述构建方法包括：将上述启动子和外源精氨酸酶编码基因导入大肠杆菌中获得。
[0019]本专利技术的第三个方面，提供上述工程益生菌在降解精氨酸中的应用。
[0020]经试验证明，本专利技术的上述工程益生菌在欠氧(如氧气受限的肠道)环境中仍能表现出优异的降解精氨酸性能，因此可作为精氨酸酶缺乏引发的相关疾病(如精氨酸酶缺乏症等)的治疗药物。
[0021]因此，本专利技术的第四个方面，提供一种药物，所述药物其活性成分包括上述工程益生菌。所述药物可用于治疗因精氨酸及其代谢产物累积引发的相关疾病(如高氨血症等)。
[0022]其中，所述药物还可以包含一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
[0023]本专利技术的第五个方面，提供一种治疗精氨酸酶缺乏引发的相关疾病(如精氨酸酶缺乏症等)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的上述工程益生菌和/或药物。
[0024]上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：
[0025](1)本专利技术首次构建在肠道中能够降解精氨酸的工程益生菌，有效降解肠道中的精氨酸，降低患者体内的精氨酸含量，可用于治疗精氨酸酶缺乏症。
[0026](2)本专利技术提供的工程益生菌，有助于治疗精氨酸酶缺乏症，可通过口服给药，提高患者生活质量，具有重要的临床治疗价值和社会效益。
附图说明
[0027]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0028]图1为本专利技术中实施例2中不同工程益生菌处理后样品上清中精氨酸浓度分析图；
[0029]图2为本专利技术中实施例3中不同处理条件下Arg KO小鼠血清中精氨酸浓度分析图。
具体实施方式
[0030]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0031]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程益生菌，其特征在于，其为大肠杆菌衍生菌，在基因组上整合厌氧启动子和外源精氨酸酶编码基因；所述大肠杆菌衍生菌具体为大肠杆菌EcN 1917的衍生菌。2.如权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，所述外源精氨酸酶编码基因具体为argI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，所述厌氧型启动子，其选自如下任意一种：厌氧型启动子P
fnrS
，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；厌氧型启动子P
nirB
，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；厌氧型启动子P
adhE
，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；厌氧型启动子P
vgb
，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。4.权利要求1
‑
3任一项所述工程益生菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将启动子和外源精氨酸酶编码基因导入大肠杆菌中获得。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括：S1、将精氨酸酶编码基因argI基因置于厌氧型启动子下游，获得启动子连接的ArgI的表达序列；S2、EcN 1917为底盘菌，通过Crisper
‑
Cas9的基因编辑手段将步骤S1制得的基因片段整合到基因组上。6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：(1)通过序列合成的方式分别获得P
fnrS
启动子和argI基因的融合片段Arg，连接到载体上，获得质粒pArg；(2)以EcN 1917基因组为模板，L
‑
F/L
‑
R为引物PCR扩增获得上游同源臂L
‑
arm，R
‑
F/R
‑
R为引物PCR扩增获得下游同源臂R
‑
arm；利用pArg...

【专利技术属性】
技术研发人员：张佩佩，曹广祥，宗工理，付加芳，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：