一种提高减毒单增李斯特菌膜囊泡产量的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种提高减毒单增李斯特菌膜囊泡产量的方法及应用，从减毒李斯特菌LMΔactAplcB出发，构建了敲除dal、dat基因的LMΔactAplcBdaldat减毒菌株，同时构建携带dal基因的回补质粒pCW633，并将其电转入减毒营养缺失株LMΔactAplcBdaldat中，构建稳定的建重组菌株LMΔactAplcBdaldat::pCW633。相比于抗生素处理的方法，本发明专利技术构建的重组菌株LMΔactAplcBdaldat::pCW633分泌MVs的产量增加更显著。本发明专利技术可解决减毒LM MVs产量低的问题，可用于减毒LM MVs相关的基础和应用研究。MVs相关的基础和应用研究。MVs相关的基础和应用研究。

【技术实现步骤摘要】
一种提高减毒单增李斯特菌膜囊泡产量的方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种提高减毒单增李斯特菌膜囊泡产量的方法及应用。

技术介绍

[0002]细菌细胞外囊泡(Bacterial membrane vesicles,BMVs)是由细菌在生长过程中释放至胞外环境的一种脂质双层膜纳米结构，其直径介于20
‑
200nm之间，其上含有多种菌体成分，包括脂质、蛋白、核酸等，可以介导细菌
‑
细菌、细菌
‑
宿主的相互作用，参与细菌致病、信号传递、群体感应、压力应激等多种生物学活动。BMVs依据来源菌的革兰染色特性可分为革兰阴性菌(Gram
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negative bacteria,G
‑
)分泌的外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)与革兰阳性菌(Gram
‑
positive bacteria,G
+
)分泌的膜囊泡(Membrane vesicles,MVs)，这两种BMVs的分泌机制有所不同，结构组分因来源细菌的细胞壁结构与组成成分的不同也存在较大差别。BMVs上复杂多样的组分使其具有良好的免疫原性，可有效刺激机体产生免疫应答。而纳米级囊状结构又赋予其携带外源抗原与包载小分子药物的能力，因此，BMVs被认为是一种有前景的疫苗载体平台或药物递送系统。已获上市的B群脑膜炎疫苗MenBvac就是基于脑膜炎奈瑟球菌OMVs研发，这也证明BMVs具有广阔的应用前景。/>[0003]目前，有关BMVs的研究多集中在革兰阴性菌分泌的OMVs上，包括大肠杆菌、脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌等分泌的OMVs。但值得注意的是，OMVs含有G
‑
菌细胞膜特有组分——内毒素脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，这种致热原的存在使得以OMVs为基础的生物制剂的安全性值得质疑，这也在一定程度上限制了OMVs的应用。而G
+
菌产生的MVs不含有内毒素LPS，故安全性更好。因此，以G
+
菌MVs为基础研发的生物制剂相较于OMVs而言更具优势。但目前基于MVs的研究相对较少，仅金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等少数G
+
菌有见报道，主要限制因素在于G
+
菌MVs的产量相对较低。而MVs的分泌与细菌细胞壁肽聚糖层的交联程度有关。
[0004]李斯特菌属(Listeria)是一类G
+
无芽胞短杆菌，胞内寄生，目前已发现多个菌种，常见包括单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)与绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii,LI)。LM、LI可产生内化素、溶血素等多种毒力因子，促进吞噬与逃逸溶酶体，可同时激起机体细胞与体液免疫应答。2013年，Lee等首次发现LM也可产生MVs。研究发现，LM MVs与其他MVs相似，具有良好生物安全性、较高的免疫原性，可负载外源抗原等优点，但同样存在产量较低的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种提高减毒单增李斯特菌膜囊泡产量的方法及应用。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种提高减毒单增李斯特菌膜囊泡产量的方法，具体步骤如下：
[0008](1)敲除单增李斯特菌减毒株LMΔactAplcB的dal、dat基因，获得菌株LMΔactAplcBdaldat，并制备LMΔactAplcBdaldat感受态细胞；
[0009](2)将打靶质粒pCW633电转入LMΔactAplcBdaldat感受态细胞中，得到菌株LMΔactAplcBdaldat::pCW633；
[0010](3)培养LMΔactAplcBdaldat::pCW633，离心取上清，提取纯化得到减毒单增李斯特菌膜囊泡，即减毒LM MVs。
[0011]作为优选的技术方案之一，步骤(1)的具体方法如下：
[0012](1
‑
1)单增李斯特菌减毒株LMΔactAplcB制备得到感受态细胞LMΔactAplcB，将打靶质粒pCW619
‑
LMdal电转入LMΔactAplcB感受态细胞中，电转复苏后培养，利用如SEQ ID NO.1所示的引物pCW619
‑
Lmdal
‑
F和SEQ ID NO.2所示的引物pCW619
‑
R进行菌落PCR筛选，同源重组，利用如SEQ ID NO.3所示的引物LMdal
‑
F、SEQ ID NO.4所示的引物LMdal
‑
R、SEQ ID NO.5所示的引物HomoLMdal
‑
F、SEQ ID NO.6所示的引物HomoLMdal
‑
R进行菌落PCR筛选，得到菌株LMΔactAplcBdal，制备LMΔactAplcBdal感受态细胞；
[0013](1
‑
2)将打靶质粒pCW619
‑
LMdat电转入LMΔactAplcBdal感受态细胞中，电转复苏后培养，利用如SEQ ID NO.7所示的引物pCW619
‑
Lmdat
‑
F、SEQ ID NO.2所示的引物pCW619
‑
R进行菌落PCR筛选，同源重组，利用如SEQ ID NO.8所示的引物LMdat
‑
F、SEQ ID NO.9所示的引物LMdat
‑
R、SEQ ID NO.10所示的引物HomoLMdat
‑
F、SEQ ID NO.11所示的引物HomoLMdat
‑
R进行菌落PCR筛选，得到菌株LMΔactAplcBdaldat，制备LMΔactAplcBdaldat感受态细胞。
[0014]作为进一步优选的技术方案之一，步骤(1
‑
1)中，打靶质粒pCW619
‑
LMdal的制备方法如下：将携带pCW619
‑
LMdal质粒的大肠杆菌菌种划线接种至添加100μg/mL氨苄西林的LB固体培养基，于37℃培养16小时；挑取单菌落接种至添加100μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中，于37℃，200rpm摇育16小时，提取质粒pCW619
‑
LMdal。
[0015]作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，菌株LMΔactAplcBdaldat::pCW633的制备方法如下：将打靶质粒pCW633电转入LMΔactAplcBdaldat感受态细胞中，电转复苏后培养，利用如SEQ ID NO.22所示的引物asd
‑
SX
‑
F、SEQ ID NO.23所示的引物asd
‑
SX...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高减毒单增李斯特菌膜囊泡产量的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)敲除单增李斯特菌减毒株LMΔactAplcB的dal、dat基因，获得菌株LMΔactAplcBdaldat，并制备LMΔactAplcBdaldat感受态细胞；(2)将打靶质粒pCW633电转入LMΔactAplcBdaldat感受态细胞中，得到菌株LMΔactAplcBdaldat::pCW633；(3)培养LMΔactAplcBdaldat::pCW633，离心取上清，提取纯化得到减毒单增李斯特菌膜囊泡，即减毒LM MVs。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法如下：(1
‑
1)单增李斯特菌减毒株LMΔactAplcB制备得到感受态细胞LMΔactAplcB，将打靶质粒pCW619
‑
LMdal电转入LMΔactAplcB感受态细胞中，电转复苏后培养，利用如SEQ ID NO.1所示的引物pCW619
‑
Lmdal
‑
F和SEQ ID NO.2所示的引物pCW619
‑
R进行菌落PCR筛选，同源重组，利用如SEQ ID NO.3所示的引物LMdal
‑
F、SEQ ID NO.4所示的引物LMdal
‑
R、SEQ ID NO.5所示的引物HomoLMdal
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F、SEQ ID NO.6所示的引物HomoLMdal
‑
R进行菌落PCR筛选，得到菌株LMΔactAplcBdal，制备LMΔactAplcBdal感受态细胞；(1
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2)将打靶质粒pCW619
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LMdat电转入LMΔactAplcBdal感受态细胞中，电转复苏后培养，利用如SEQ ID NO.7所示的引物pCW619
‑
Lmdat
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F、SEQ ID NO.2所示的引物pCW619
‑
R进行菌落PCR筛选，同源重组，利用如SEQ ID NO.8所示的引物LMdat
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F、SEQ ID NO.9所示的引物LMdat
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R、SEQ ID NO.10所示的引物HomoLMdat
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F、SEQ ID NO.11所示的引物HomoLMdat
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R进行菌落PCR筛选，得到菌株LMΔactAplcBdaldat，制备LMΔactAplcBdaldat感受态细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，菌株LMΔactAplcBdaldat::pCW633的制备方法如下：将打靶质粒pCW633电转入LMΔactAplcBdaldat感受态细胞中，电转复苏后培养，利用如SEQ ID NO.22所示的引物asd
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SX
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F、SEQ ID NO.23所示的引物asd
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SX
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R进行菌落PCR筛选，得到菌株LMΔactAplcBdaldat::pCW633。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，打靶质粒pCW633的制备方法如下：(2
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A)培养携带pCW630质粒的大肠杆菌，提取质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪川，唐明圆，雷瑶，陈科翰，田思成，张秋阳，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：