一种提高大肠杆菌鲁棒性的重组菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种提高大肠杆菌鲁棒性的重组菌及其构建方法；通过将甲基乙二醛合酶基因mgsA替换为来自酵母的截短的角鲨烯合酶基因tErg9；在此基础上将磷酸乙酰转移酶基因pta替换为来自酸热脂环酸芽孢杆菌的角鲨烯

【技术实现步骤摘要】
一种提高大肠杆菌鲁棒性的重组菌及其构建方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及微生物合成生物学领域，具体涉及一种提高大肠杆菌鲁棒性的重组菌及其构建方法，尤其涉及一种提高大肠杆菌耐受性和产物合成能力的重组菌及其构建方法。

技术介绍

[0002]生物质是一种可再生的清洁资源，通过生物制造技术，可以被转化为燃料、大宗化学品和天然产物，从而部分替代石油化工炼制和植物提取。目前，在工业生物技术中，一些重要的微生物，包括细菌和酵母，已经被广泛应用于发酵过程，作为细胞工厂以生产药品、保健品、酶、食品成分、燃料和生物化学品(Marta Tous Mohedano et al.,2022)。为了满足商业需求，微生物细胞通常需要被改造，用于有效地生物合成有价值的化学物质，最终实现特定的指标，如效度、产量和生产力。微生物发酵具有成本低、无化学残留物、产量高等明显优点，被认为是生物制造的核心，而其中的大肠杆菌由于具有遗传背景清晰、生理背景明确、易于培养、迭代时间短、遗传操作手法成熟等一系列优点，被作为最常用的底盘细胞广泛用于微生物细胞工厂的构建。
[0003]生物制造的核心技术是构建高效的微生物细胞工厂，将生物质原材料转化为各种终端产品。但是微生物细胞工厂在生产化合物的过程中，往往会暴露在各种不同的胁迫中，这些压力来自原料、新陈代谢或工业生产过程，如上游生物质衍生糖(例如纤维素水解液)制备过程中产生的呋喃以及酚类化合物等杂质，生产过程积累的有毒中间体、不良副产物，下游发酵过程中存在的高温、酸碱、高盐等不利的工业条件，所合成的终产物对细胞自身的反噬，这一系列不利条件会对细胞工厂产生毒害作用，从而极大的限制菌株的生长和产物合成能力。
[0004]研究表明，合成产物引起E.coli细胞毒害的机制有多种，包括导致细胞膜损伤、DNA损伤、引起蛋白质变性和诱导活性氧(ROS)的产生等。尽管不同化合物对细胞的毒性机制各有不同，但细胞膜的损伤被认为是多种化合物引起细胞毒害的重要共性机制。E.coli细胞膜细胞膜作为细胞屏障，负责维持细胞内微环境稳定，并参与同外界环境进行物质交换、能量运输和信息传递的过程；另外，细胞膜上含有丰富的酶系，执行许多重要的代谢功能，对维持和调节细胞生理和代谢至关重要。因此，构建鲁棒性的E.coli细胞膜，提高其面对有毒产物和底物时的耐受性，是解决细胞膜损伤这一问题的有效策略。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种提高大肠杆菌鲁棒性的重组菌及其构建方法。本专利技术通过人工合成途径将非天然膜组分引入大肠杆菌，通过重塑E.coli细胞膜改造大肠杆菌底盘细胞耐受性，构建出高效的微生物细胞工厂，能够极大地提升目前工业微生物的发酵能力，提高其生理性能。具体来说，本专利技术采用CRISPR
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cas9基因编辑技术，将宿主菌MG1655中编码甲基乙二醛合酶基因mgsA替换为来自酵母的截短的角鲨烯合酶
基因tErg9，并运用人工启动子策略上调tErg9的表达；在所得重组菌基础上采用CRISPR
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cas9基因编辑技术继续将重组菌磷酸乙酰转移酶基因pta替换为来自酸热脂环酸芽孢杆菌的角鲨烯
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藿烯环化酶基因shc，并运用人工启动子策略上调shc的表达，得到重组工程菌，所得到的重组大肠杆菌没有抗性，对多种化合物抑制剂具有广谱耐受性，能够生产C8化合物。其中，所述人工启动子元件为M1
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93，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种鲁棒性提高的重组大肠杆菌，该重组菌为引入了非天然膜组分hopanoids的重组大肠杆菌；非天然膜组分hopanoids的合成是通过大肠杆菌內源MEP途径结合引入的外源人工合成途径进行。
[0008]进一步的，对內源MEP途径关键限速酶进行人工调控。
[0009]內源MEP途径关键限速酶內源MEP途径关键限速酶包括1
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脱氧
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D
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木酮糖
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磷酸合酶基因Dxs和异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi。
[0010]大肠杆菌內源MEP途径包括(副产物合成基因)甲基乙二醛合酶(Methylglyoxal synthase)基因mgsA和磷酸乙酰转移酶(Phosphate acetyltransferase)基因pta。
[0011]引入的外源人工合成途径包括(来自酵母的截短的)角鲨烯合酶(truncated S.cerevisiae squalene synthase gene erg9)基因tErg9和(来自酸热脂环酸芽孢杆菌的)角鲨烯
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藿烯环化酶(Squalene
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hopene cyclase)基因shc。
[0012]具体的，所述重组大肠杆菌依次将两个副产物合成基因敲除，并引入一条人工合成途径，即依次将来自酵母的截短的角鲨烯合酶基因tErg9、来自酸热脂环酸芽孢杆菌的角鲨烯
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藿烯环化酶基因shc整合到MgsA和pta两个位点。
[0013]本专利技术中，来自酵母的截短的角鲨烯合酶能够催化大肠杆菌体内前体物质法尼基二磷酸酯FPP合成角鲨烯(squalene)，随后来自酸热脂环酸芽孢杆菌的角鲨烯
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藿烯环化酶将角鲨烯催化为藿烷，是一种固醇类似物。藿烷插入到磷脂双分子层中，降低了细胞膜的流动性，增强了大肠杆菌耐酸碱与耐渗透压的能力。
[0014]作为本专利技术的一个实施方案，将大肠杆菌中的甲基乙二醛合酶基因mgsA替换为角鲨烯合酶基因tErg9，并运用人工启动子策略上调tErg9的表达；将磷酸乙酰转移酶基因pta替换为角鲨烯
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藿烯环化酶基因shc，并运用人工启动子策略上调shc的表达；得到(引入了外源人工合成途径的)重组大肠杆菌。记为重组E.coli菌ΔmgsA::tErg9Δpta::shc。
[0015]作为本专利技术的一个实施方案，编码大肠杆菌中甲基乙二醛合酶基因mgsA的核苷酸的序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；编码大肠杆菌中磷酸乙酰转移酶基因pta的核苷酸的序列包括SEQ ID NO.3所示的序列；编码所述(外源合成途径的来自酵母的截短的)角鲨烯合酶基因tErg9、(来自酸热脂环酸芽孢杆菌的)角鲨烯
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藿烯环化酶基因shc的核苷酸的序列包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4所示的序列。
[0016]作为本专利技术的一个实施方案，所述酵母包括S.cerevisiae BY4742，所述酸热脂环酸芽孢杆菌包括Alicyclobacillus acidocaldarius subsp.acidocaldarius。
[0017]作为本专利技术的一个实施方案，所述外源人工合成途径包括人工调控元件M1
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tEr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鲁棒性提高的重组大肠杆菌，其特征在于，为引入了非天然膜组分hopanoids的重组大肠杆菌；非天然膜组分hopanoids的合成是通过大肠杆菌內源MEP途径结合引入的外源人工合成途径进行。2.根据权利要求1所述的鲁棒性提高的重组大肠杆菌，其特征在于，将大肠杆菌中的甲基乙二醛合酶基因mgsA替换为角鲨烯合酶基因tErg9，并运用人工启动子策略上调tErg9的表达；将磷酸乙酰转移酶基因pta替换为角鲨烯
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藿烯环化酶基因shc，并运用人工启动子策略上调shc的表达，得到重组工程菌。3.根据权利要求2所述的鲁棒性提高的重组大肠杆菌，其特征在于，还包括对所得重组工程菌內源MEP途径关键限速酶进行人工调控的步骤。4.根据权利要求3所述的鲁棒性提高的重组大肠杆菌，其特征在于，所述对內源MEP途径关键限速酶进行人工调控是将1
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脱氧
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D
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木酮糖
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磷酸合酶基因Dxs和异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi的启动子分别替换为人工增强启动子M1
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37和M1
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46；所述M1
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37的核苷酸序列包括SEQ ID NO.6所示，M1
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46的核苷酸序列包括SEQ ID NO.7所示。5.一种根据权利要求2所述的鲁棒性提高的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)根据所要替换的基因mgsA，所需整合的M1
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tErg9人工调控元件，构建相应的pTargetF
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N20质粒及DonorDNA；根据所要替换的基因pta，所需整合的M1
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shc人工调控元件，构建相应的pTargetF
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N20质粒及DonorDNA；(2)将其中一种pTargetF
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N20质粒及DonorDNA采用电转化法转化至含有pCas质粒的大肠杆菌感受态中；诱导pCas质粒上sgRNA的转录，消除pTargetF
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N20质粒并筛选出基因改造成功的菌株；(3)将另一种未转化的pTargetF
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N20质粒及DonorDNA转化至步...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭在高，孙文杰，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：