一种多酶协同表达重组基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种多酶协同表达重组基因工程菌，以及其在生物催化制备L

【技术实现步骤摘要】
一种多酶协同表达重组基因工程菌及其应用
(一)

[0001]本专利技术涉及一种多酶协同表达重组基因工程菌，以及其在生物催化制备L
‑2‑
氨基丁酸中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]L
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氨基丁酸(L
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aminobutyricacid，L
‑
ABA)是一种非天然氨基酸，可以提高葡萄糖磷酸酯酶活性，促进脑细胞新陈代谢，医学临床用于无痛去龋和脑血管病后遗症，并且具有降压功效。此外，L
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氨基丁酸还是一种重要的化工原料和医药中间体，可通过酰胺化制备(S)
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氨基丁酰胺盐，是合成抗癫痫药左乙拉西坦的关键中间体，也可通过还原末端羧基用于制备(S)
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氨基丁醇，并被用来合成乙胺丁醇。L
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氨基丁酸的工业化生产技术已成为制药工程研究的热点。
[0003]L
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氨基丁酸的制备方法主要包括化学合成法、生物合成法两种。其中化学法包括脱硫反应、氨化水解反应、丁酮酸还原法等。化学合成策略存在明显的缺点，如选择性差、反应条件苛刻、副产物种类繁多、分离纯化难度大等。
[0004]L
‑2‑
氨基丁酸的生物合成方法包括微生物发酵法、酶的手性拆分法及酶转化法三种。微生物发酵法是以葡萄糖为营养物质，通过改造后的大肠杆菌生产L
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氨基丁酸。手性拆分法是将混旋型的DL
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氨基丁酸通过D/>‑
氨基氧化酶作用将D
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氨基丁酸氧化掉生成酮酸，再用转氨酶或氨基酸脱氢酶催化使酮酸重新转化成L
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氨基丁酸，使得原先的混旋物变成光学纯的L
‑2‑
氨基丁酸。L
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氨基丁酸的合成大部分研究都集中在酶转化法。通过以L
‑
苏氨酸为底物，通过转氨酶的作用转化为2
‑
酮丁酸，在通过脱氢酶的作用将其转化成L
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氨基丁酸，同时再偶联辅酶循环体系，提高辅酶的利用率可以极大的提高产量。酶转化法由于其转化效率高、原料价格便宜、无副产物生成、产品易于提取、环境友好等特点，被越来越多的研究和应用。
[0005]核糖体结合位点是指起始密码子AUG上游的一段富含嘌呤的非翻译区，在RBS中有SD(Shine
‑
Dalg
‑
arno)序列，长度一般为5个核苷酸，富含G,A，该序列与核糖体16SrRNA的3'端互补配对，促使核糖体结合到mRNA上，有利于翻译的起始。RBS的结合强度取决于SD序列的结构及其与起始密码AUG之间的距离。SD与AUG之间相距一般以4～10个核苷酸为佳，9个核苷酸最佳。
(三)
技术实现思路

[0006]本专利技术目的是提供了一种酶表达量高，底物转化率高的亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达重组基因工程菌，将其应用于L
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氨基丁酸的工业化生产中，利用细胞多酶协同表达系统，实现反应过程中对高浓度底物的催化反应。
[0007]本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种多酶协同表达重组基因工程菌，由如下方法构建获得：采用单质粒双基因表达载体，在其多克隆位点插入甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因，并将其限制性酶位点
前的RBS序列替换为CTACCCCCAAGGTTGATAAGGAGGTATTTT，转化宿主细胞，得到所述多酶协同表达重组基因工程菌；所述亮氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009]所述单质粒双基因表达载体为pACYCDuet、pCDFDuet、pETDuet或pRSFDuet之一。所述重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。
[0010]优选的，所述单质粒双基因表达载体为pRSFDuet，在其MCS1和MCS2中插入甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因，获得pRSFDuet
‑
fdh
‑
Leudh，并将其MCS1的RBS序列替换为CTACCCCCAAGGTTGATAAGGAGGTATTTT。
[0011]本专利技术还涉及所述的重组基因工程菌在生物催化制备L
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氨基丁酸中的应用。
[0012]具体的，所述应用为：以所述的重组基因工程菌经发酵培养获得的活细胞为催化剂，以L
‑
苏氨酸为起始底物、甲酸铵作为辅酶循环再生的辅底物，并添加苏氨酸脱氨酶，以去离子水为反应介质构成反应体系，进行酶催化反应，反应结束后，得到含L
‑2‑
氨基丁酸的反应液，反应液经过分离纯化，得到所述L
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氨基丁酸。
[0013]重组基因工程菌的发酵培养方法为：将重组基因工程菌接种于含有抗生素的培养基中培养，获得种子液，经扩大培养获得OD600达到0.6～0.9的菌液，加入IPTG作为诱导剂，22
‑
28℃诱导10
‑
18h，发酵培养结束后，收集湿菌体。
[0014]培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本专利技术的培养基，优选为TB培养基，TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，丙三醇5g/L，三水合磷酸二氢钾2.312g/L，无水磷酸氢二钾12.54g/L，加蒸馏水溶解，pH7.0。
[0015]种子液培养的条件为37℃，180r/min条件下培养12h。扩大培养的条件为37℃，180r/min。
[0016]摇瓶培养重组基因工程菌时，采用IPTG作为诱导剂，终浓度0.06
‑
0.12mmol/L，诱导温度22
‑
30℃，诱导时间10
‑
16h。作为优选，诱导温度为28℃，诱导剂浓度为0.1mmol/L的IPTG，诱导时间为14h。
[0017]发酵罐培养基因工程菌时，采用乳糖作为诱导剂，往菌液中加到质量终浓度≥4g/L的乳糖，诱导培养13
‑
19h。作为优选，乳糖最佳诱导浓度为8g/L，诱导时间为17h。
[0018]所述反应体系中，L
‑
苏氨酸质量浓度为100～500g/L，甲酸铵质量浓度为100～200g/L，苏氨酸脱氨酶浓度为20000～30000U/L，重组基因工程菌活细胞以菌体湿重计为10～50g/L，酶催化的温度为25～40℃，反应时间为2～16h，反应开始20～30min后加入0.1～1.0g/L辅酶NAD+。
[0019]更为优选，最优的反应体系中，L
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苏氨酸质量浓度为300g/L，甲酸铵质量浓度为158g/L，苏氨酸脱氨酶浓度为25000U/L，重组基因工程菌活细胞以菌体湿重计25g/L，辅酶添加量为0.20g/L；酶催化的温度为35℃，反应时间为12h，转化率为9本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多酶协同表达重组基因工程菌，由如下方法构建获得：采用单质粒双基因表达载体，在其多克隆位点插入甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因，并将其限制性酶位点前的RBS序列替换为CTACCCCCAAGGTTGATAAGGAGGTATTTT，转化宿主细胞，得到所述多酶协同表达重组基因工程菌；所述亮氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.如权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于所述单质粒双基因表达载体为pACYCDuet、pCDFDuet、pETDuet或pRSFDuet之一。3.如权利要求1所述的重组基因工程菌，其特征在于所述单质粒双基因表达载体为pRSFDuet，在其MCS1和MCS2中插入甲酸脱氢酶基因和亮氨酸脱氢酶基因，获得pRSFDuet
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fdh
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Leudh，并将其MCS1的RBS序列替换为CTACCCCCAAGGTTGATAAGGAGGTATTTT。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建妙，马弋锋，郑裕国，柳志强，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：