本发明专利技术公开了一种促进植物益生甲基杆菌叶际定殖的方法。该方法利用甲基杆菌的突变株在植物叶际上进行定殖；该突变株是利用现代分子生物学技术敲除甲基杆菌ppsR基因序列或ppsR基因的启动子序列，或是通过随机插入突变或定点插入突变破坏ppsR基因序列降低ppsR结合到光合基因簇相关基因的启动子区域能力，或是通过定点突变改变ppsR基因的启动子序列，降低ppsR基因转录表达水平。本发明专利技术能够高效提高甲基杆菌作为植物益生菌和叶际菌肥的应用能力。实践证明，本发明专利技术获得了一种有效提高光合作用促进甲基杆菌在植物叶际上生长能力的技术策略，具有提高植物叶际定殖的显著效果，具有好的促农作物生长和生产的应用潜力。有好的促农作物生长和生产的应用潜力。有好的促农作物生长和生产的应用潜力。
【技术实现步骤摘要】
一种促进植物益生甲基杆菌叶际定殖的方法
[0001]本专利技术涉及一种通过提高植物益生甲基杆菌的光合作用促进其在植物叶际定殖的方法，属于微生物技术和现代农业领域。
技术介绍
[0002]微生物菌剂因其绿色高效、可持续施用、低副作用等优势特点在农业生产中应用越来越广泛。甲基杆菌(Methylobacterium和Methylorubrum)利用植物叶际生长代谢过程中释放的甲醇等有机碳一作为生长的唯一碳源和能源，形成植物叶际的一类优势菌群。许多甲基杆菌(如：稻谷甲基杆菌Methylobacterium oryzae、巢状甲基杆菌Mb.nodulans、扭脱甲基杆菌Methylorubrum.extorquens、耐辐射甲基杆菌Mb.radiotolerans、絮凝甲基杆菌Mb.gregans和西班牙甲基杆菌Mb.hispanicum)能够合成植物生长所需生长激素、分裂素以及释放次生代谢产物，从而促进玉米、大豆、花生、生菜、番茄、甜瓜等作物生长和抑制禾谷镰刀菌、立枯丝核菌等病原菌繁殖，是一种重要的植物叶际共生益生菌。目前美国等农业生物技术公司已开发出多种甲基杆菌菌肥和生物农药产品。
[0003]然而植物叶际表面释放甲醇随着昼夜波动且浓度低，导致叶际甲基杆菌面临寡甲醇碳源的逆境生态位，使得在不同作物上定殖效果差异大且普遍定殖效率低，促进作物生长和生产的效果不理想。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于提供一种促进植物益生甲基杆菌叶际定殖的方法，通过提高植物益生甲基杆菌的光合作用强度进而促进在植物叶际生态位定殖的方法，以弥补现有技术的不足。
[0005]基因组测序表明植物叶际分离到的甲基杆菌普遍含有光合作用所需的基因簇(Photosynthetic gene cluster，PGC)，包括合成细菌叶绿素a的bch基因簇，合成捕光蛋白复合体的puf基因簇，合成光反应中心蛋白复合体的puh基因簇，以及促进蛋白复合体自组装的调控基因lhaA和pucC，具有进行RC
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II型光合作用的能力。然而在光暗循环培养下甲基杆菌的细菌叶绿素合成量显著低于其他种属的好氧不产氧光合细菌的含量，表明甲基杆菌的光合甲基代谢营养模式主要通过氧化同化甲醇获得生长所需的碳源和能量，光合作用仅能驱动光能转化成少量化学能。
[0006]因此，提高甲基杆菌光合作用能够增强在植物叶际微生物群落中的生长竞争力和适应度，提高在植物叶际生态下的定殖，增强对植物生长的益生作用。基于此，本专利技术提供一种通过提高甲基杆菌光合作用强度促进植物叶际上定殖的有效方法，以增强甲基杆菌促进农作物的生长和生产的能力。
[0007]为了提高甲基杆菌在植物叶际定殖能力，需要一种技术策略增强甲基杆菌光合作用产能效率。本专利技术发现在甲基杆菌中敲除ppsR基因，或通过插入终止密码子使基因ppsR不能正常转录，显著提高光照培养下甲基杆菌合成细菌叶绿素a的含量和光合产能的能力，
增强在甲醇等碳源上的生长能力，大幅提高植物叶际定殖效果。
[0008]结合上述研究，为达到上述目的，本专利技术采取的具体技术方案为：
[0009]一种甲基杆菌的突变株，该突变株是利用现代分子生物学技术敲除甲基杆菌ppsR基因序列或ppsR基因的启动子序列，或是通过随机插入突变或定点插入突变破坏ppsR基因序列降低ppsR结合到光合基因簇相关基因的启动子区域能力，或是通过定点突变改变ppsR基因的启动子序列，降低ppsR基因转录表达水平。
[0010]所述现代分子生物学技术包括但不限于同源双交换技术、转座技术、CRISPR
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Cas9技术等。
[0011]进一步的，所述甲基杆菌是指以有机碳一，包括甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、甲胺等作为生长的碳源和能源的一类呈粉色的革兰氏阴性细菌，包括但不限于稻谷甲基杆菌Mb.oryzae、结瘤甲基杆菌Mb.nodulans、扭脱甲基杆菌Mr.extorquens、耐辐射甲基杆菌Mb.radiotolerans、絮凝甲基杆菌Mb.gregans和西班牙甲基杆菌Mb.hispanicum。
[0012]一种促进植物益生甲基杆菌叶际定殖的方法，该方法利用所述甲基杆菌的突变株在植物叶际上进行定殖。
[0013]进一步的，该方法具体为：液体培养所述甲基杆菌的突变株至生长指数中后期，调整菌体浓度至OD
600
为0.5左右，以该菌悬液浸泡植物种子或滴灌植物根部或喷洒植物叶际。
[0014]所述甲基杆菌的突变株能够应用于促进植物叶际生长定殖中。
[0015]进一步的，所述甲基杆菌的突变株在制备植物益生菌或叶际菌肥中的应用。
[0016]进一步的，所述植物叶际是指植物出现在地表以上的部分，包含花、茎、叶、果实；所述植物主要包括但不限于玉米、小麦、大豆、花生、西红柿、黄瓜、甜瓜等蔬果作物，杜娟花、菊花、水仙花、绣球花等观赏植物，以及其他甲基杆菌叶际定殖的植物。
[0017]所述甲基杆菌的突变株在甲醇作为碳源或丙二醇碳源上，在给光的光暗循环实验室培养条件下，有效增强光合作用基因转录，提高光合作用强度，细菌叶绿素a的合成量显著高于野生菌。所述甲基杆菌的突变株在甲醇碳源或丙二醇碳源上，在光暗循环实验室培养条件培养下，细胞内ATP的含量显著高于野生菌。所述甲基杆菌的突变株在甲醇碳源或丙二醇碳源上，在光暗循环实验室培养条件培养下，具有显著高于野生菌的生长能力，包括提高生长速率和提高生物量得率。
[0018]本专利技术的优点和有益效果
[0019]本专利技术提供了一种甲基杆菌的改进菌株，敲除ppsR基因或启动子序列，或是通过插入失活破坏ppsR基因，都能增强光合作用基因转录水平提高细菌叶绿素a的合成量，提高胞内ATP含量，提高在甲醇等碳源上生长能力，最终显著提高在不同科属植物叶际上定殖效果；经过实际验证，施用菌剂3周后植物叶际甲基杆菌的突变株定殖量达每克叶际植物鲜重108‑
109CFU以上。
[0020]本专利技术能够高效提高甲基杆菌作为植物益生菌和叶际菌肥的应用能力。实践证明，本专利技术获得了一种有效提高光合作用促进甲基杆菌在植物叶际上生长能力的技术策略，具有提高植物叶际定殖的显著效果，具有好的促农作物生长和生产的应用潜力。
附图说明
[0021]图1为甲基杆菌模式菌扭脱甲基杆菌野生菌株在光暗循环(LD)与纯黑暗(D)培养
条件下光合作用相关基因的转录水平对比结果图(A)，与扭脱甲基杆菌光暗循环培养条件下产生细菌叶绿素a的高分辨质谱鉴定(B)。
[0022]图2为甲基杆菌模式菌扭脱甲基杆菌敲除基因ppsR突变菌株在光暗循环(LD)与纯黑暗(D)培养条件下光合作用相关基因转录水平对比结果图。
[0023]图3为扭脱甲基杆菌中敲除基因ppsR的突变菌株在1,2
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丙二醇(A)及甲醇(B)碳源条件下细菌叶绿素a合成量均显著高于野生菌株的结果对比图。其中AM1_LD:光暗循环培养模式的扭脱甲基杆菌野生菌株；AM1Δ本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种甲基杆菌的突变株，其特征在于，该突变株是利用现代分子生物学技术敲除甲基杆菌ppsR基因序列或ppsR基因的启动子序列，或是通过随机插入突变或定点插入突变破坏ppsR基因序列降低ppsR结合到光合基因簇相关基因的启动子区域能力，或是通过定点突变改变ppsR基因的启动子序列，降低ppsR基因转录表达水平。2.如权利要求1所述的甲基杆菌的突变株，其特征在于，所述现代分子生物学技术包括同源双交换技术、转座技术、CRISPR
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Cas9技术。3.如权利要求1所述的甲基杆菌的突变株，其特征在于，所述甲基杆菌是指以有机碳一，包括甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、甲胺等作为生长的碳源和能源的一类呈粉色的革兰氏阴性细菌，包括但不限于稻谷甲基杆菌Mb. oryzae、结瘤甲基杆菌Mb. nodulans、扭脱甲基杆菌Mr. extorquens、耐辐射甲基杆菌Mb. radiotolerans、絮凝甲基杆菌Mb...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨松，张聪，冯晨曦，马增新，孙静，邵云洁，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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