一种趋磁细菌工程菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种趋磁细菌工程菌株及其构建方法和应用。所述趋磁细菌工程菌株中同时含有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、或者SEQ ID NO.3所示的磁小体合成关键基因和如SEQ ID NO.4所示的启动子，该趋磁细菌工程菌株构建对提高磁小体数量有显著影响，且其构建方法步骤简单，安全性高，开发出的工程菌株，能够在免疫磁性分离、检测技术和靶向肿瘤治疗等领域中被广泛应用，对于医疗事业具有重要意义。对于医疗事业具有重要意义。对于医疗事业具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种趋磁细菌工程菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种趋磁细菌工程菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]趋磁细菌(Magnetotactic bacteria,MTB)是能在磁场作用下，一类可以进行定向趋磁运动的细菌的总称。趋磁细菌为厌氧或微好氧的革兰氏阴性细菌，有球状、杆状、弧形、螺旋状及多细胞聚集等类型，广泛分布于海洋、淡水等不同地区的地质沉积物中。由于趋磁细菌的遗传操作体系尚不完善,使得在分子水平上研究其遗传学进展缓慢。
[0003]磁小体是由趋磁细菌在体内产生的一种矿物质晶体，其颗粒均一,有稳定的晶体和磁学性质,表面由双层磷脂包被。磁小体的这些特点使其能够作为多种化合物和生物分子的载体,利用脂膜及其具有的各种基团来连接化合物或锚定蛋白。磁小体生物合成过程主要包括：质膜内陷引发磁小体膜的形成、铁的吸收及转运及磁核的矿化及成熟、磁小体链的有序组装。与人工磁性材料相比,磁小体具有各种优良的特性,能够在免疫磁性分离、检测技术和靶向肿瘤治疗等领域中被广泛应用。
[0004]格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense MSR
‑
1)基因组中发现的MamAB操纵子对磁小体合成有核心作用。MamAB操纵子由18个线性排列的基因组成，长约16.4kb。mamA基因产生的蛋白是构成磁小体膜的成分之一，在磁小体的外表面，该基因也可促进磁小体囊泡正确行使功能，同时，mamA蛋白的TPR结构使其具有介导蛋白之间相互作用的潜能。mamR基因构成的突变株合成的磁小体较小，形状也有缺陷；mamR可能参与控制磁小体链的大小以及晶体的性质，但与晶型无关。mamP蛋白因含有PDZ结构域，有助于它与其它蛋白的相互作用，mamP还是另一个预测含有亚铁血红素的磁小体蛋白，该蛋白与血红素结合后，可能参与一个信号传导途径，按环境的需要决定磁小体合成的数量，mamP基因突变株的合成的磁小体较少，但体积增大。
[0005]本专利技术通过对一种磁小体关键基因过表达工程菌株的构建，得到的工程菌株磁螺菌能够显著提高趋磁细菌产生磁小体的能力。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种趋磁细菌工程菌株及其构建方法和应用。本专利技术构建的工程菌株中含有磁小体合成关键基因，且构建方法步骤简单，构建的三个趋磁细菌工程菌株具有显著提高产生磁小体的能力。
[0007]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0008]本专利技术提供了一种趋磁细菌工程菌株，所述趋磁细菌工程菌株中同时含有磁小体合成关键基因和启动子。
[0009]进一步的，所述磁小体合成关键基因具有下列核苷酸序列之一：
[0010](1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
[0011](2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
[0012](3)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
[0013](4)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、或者SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、或者SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有95％以上同源性的，且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。
[0014]进一步的，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0015]进一步的，所述趋磁细菌工程菌株能够显著提高产生磁小体的能力。
[0016]本专利技术还提供了所述的磁细菌工程菌株的构建方法，其特征在于，其包含以下步骤：
[0017](1)提取磁螺菌的基因组；
[0018](2)以提取的磁螺菌基因组为模板，扩增得到目的基因和启动子片段；
[0019](3)将目的基因和启动子片段进行重叠延伸；
[0020](4)将步骤(3)得到的延伸产物和质粒分别进行酶切后，将得到的酶切产物分别进行酶连，得到重组质粒；
[0021](5)将步骤(4)的重组质粒转化感受态细胞，得到重组菌株；
[0022](6)将重组菌株和野生型磁螺菌进行接合，筛选验证正确的工程菌株，得到磁细菌工程菌株。
[0023]进一步的，所述步骤(1)中，目的基因具体为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的mamA基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的mamR基因、或者核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的mamP基因。
[0024]进一步的，所述扩增mamA基因的引物的序列为：
[0025]mam A
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F：5'
‑
CCGGAGATCAATGTCTAGCAAGCCGTCGAATATG
‑
3'；mam A
‑
R：5'
‑
CCCGGTATCGATAAGCTTTTAGACGGCCGAACGTTCATCG
‑
3'；所述扩增mamR基因的引物的序列为：
[0026]mam R
‑
F：5'
‑
GCCGGAGATCAATGACCTTTGTTCAGGGCGCCATGG
‑
3'；
[0027]mam R
‑
R：5'
‑
CCCGGTATCGATAAGCTTTCATCGGTTCATGTATTCCAC
‑
3'；
[0028]所述扩增mamP基因的引物的序列为：
[0029]mam P
‑
F：5'
‑
GCCGGAGATCAATGAATAGCAAACTCGTCCTGC
‑
3'；mam P
‑
R：5'
‑
CCCGGTATCGATAAGCTTTCATCGGTTCATGTATTCCAC
‑
3'。
[0030]进一步的，所述启动子为核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的Pmam DC，其扩增引物序列为：
[0031]Pmam DC
‑
F：5'
‑
CCGCTGCAGGAATTCTTTAAGGGGCAGAGAGGGAATC
‑
3'；Pmam DC
‑
A
‑
R：5'
‑
CTAGACATTGATCTCCGGCAAGTGTATGCAC
‑
3'；或者Pmam DC
‑
R
‑
R：5'
‑
CAAAGGTCATTGATCTCCGGCAAGTGTATGC
‑
3'；或者Pmam DC
‑
P
‑
R：5'
‑
GTTTGCTATTCATTGATCTCCGGCAAGTGTATG
‑
3'。
[0032]进一步的，所述步骤(4)中酶连时，所述延伸产物和质粒的酶切产物的体积比为5:2～4:3。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种趋磁细菌工程菌株，其特征在于，所述趋磁细菌工程菌株中同时含有磁小体合成关键基因和启动子。2.根据权利要求1所述的趋磁细菌工程菌株，其特征在于，所述磁小体合成关键基因具有下列核苷酸序列之一：(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(2)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；(4)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列、或者SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、或者SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有95％以上同源性的，且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的趋磁细菌工程菌株，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。4.根据权利要求1所述的趋磁细菌工程菌株，其特征在于，所述趋磁细菌工程菌株能够显著提高产生磁小体的能力。5.权利要求1所述的磁细菌工程菌株的构建方法，其特征在于，其包含以下步骤：(1)提取磁螺菌的基因组；(2)以提取的磁螺菌基因组为模板，扩增得到目的基因和启动子片段；(3)将目的基因和启动子片段进行重叠延伸；(4)将步骤(3)得到的延伸产物和质粒分别进行酶切后，将得到的酶切产物分别进行酶连，得到重组质粒；(5)将步骤(4)的重组质粒转化感受态细胞，得到重组菌株；(6)将重组菌株和野生型磁螺菌进行接合，筛选验证正确的工程菌株，得到磁细菌工程菌株。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，目的基因具体为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的mamA基因、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的mamR基因、或者核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的mamP基因。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述扩增mamA基因的引物的序列为：mam A
‑
F：5'
‑
CCGGAGATCAATGTCTAGCAAGCCGTCGAATATG
‑
3'；mam A
‑
R：5'
‑
CCCGGTATCGATAAGCTTTTAGACGGCCGAACGTTCATCG
‑
3'；所述扩增mamR基因的引物的序列为：mam R
‑
F：5'<...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨建明，梁波，王慧，王兆宝，汤若昊，李美洁，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：