一种低频超声场辅助酶解制备降脂牡蛎肽的方法技术

本发明专利技术涉及多肽技术领域，为开发牡蛎蛋白资源，公开了一种低频超声场辅助酶解制备降脂牡蛎肽的方法，包括以下步骤：由脱壳、去内脏团的牡蛎组织经高温变性、提取蛋白、低频超声场辅助胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶和风味蛋白酶双酶二次酶解、灭活、收集500～1000Da的分子、再分离纯化得到。本发明专利技术利用胃蛋白酶酶解，再经胰蛋白酶和风味蛋白酶双酶二次酶解，并全过程酶解采用间歇式低频超声场辅助，获得的牡蛎肽，蛋白质含量高，分子量小，易于人体吸收利用，在胃肠道环境具稳定性，且得率高。且得率高。且得率高。

【技术实现步骤摘要】
一种低频超声场辅助酶解制备降脂牡蛎肽的方法


[0001]本专利技术涉及多肽
，尤其是涉及一种低频超声场辅助酶解制备降脂牡蛎肽的方法。

技术介绍

[0002]近年来随着物质生活水平的不断提高，我国居民从传统的植物性食物为主的膳食结构向高脂肪、低碳水化合物的膳食结构发展，导致肥胖的发生率逐年增加。当前肥胖已经成为全球性的公共卫生问题而被广泛关注。许多研究已经证明了肥胖是代谢综合征发生最常见的危险因素，而且还是糖尿病、心脑血管疾病和多种癌症发生的重要诱因。目前，治疗肥胖的药物主要分为非中枢性减肥药、中枢性减肥药和降糖药物，长期服用会引起肝损害、油性大便、心慌、手抖等不良反应。然而食品功能性物质在肥胖的缓解或预防的应用时却未见异常反应。因此，从食物蛋白中发掘减脂功能的活性肽是对肥胖人群减重降脂治疗的代替手段。
[0003]牡蛎蛋白及其水解物被报道具有多种生物活性，例如降血压，抗血栓等，但其对降脂活性尚未见报道或公布。为了提高牡蛎蛋白的利用度，通常先采用碱溶酸沉方法提取制备较高含量的牡蛎蛋白，然而该方法制备的牡蛎蛋白水溶性颗粒度大，基于常规的酶解方法，其水解度以及酶解效率均较为低下，最终导致获得的目标功能多肽生产量低。本专利的多肽制备技术方案采用了高温变性后的去内脏团牡蛎组织蛋白，采用间歇式低频超声场辅助胃蛋白酶酶解，以及胰蛋白酶和风味蛋白酶双酶二次酶解，提高了蛋白的水解率和目标多肽的生产率，同时还提高了酶的利用率。本专利采用低频超声场辅助酶解，经检索，未见该方法未与酶解同时使用的报道，具有创新性、高效率的优势。

技术实现思路

[0004]为开发牡蛎资源，本专利技术的目的在于：提供一种降脂牡蛎肽的制备方法，通过对牡蛎原材料进行高温变性、酶解等工序得到牡蛎制备的多肽，本专利技术制备的牡蛎多肽，分子量小，产量高，活性高，可以显著降低高脂饮食小鼠的体重。
[0005]为实现本专利技术的技术目的，本专利技术提供如下的技术方案：
[0006]一种低频超声场辅助酶解制备降脂牡蛎肽的方法，包括以下步骤：
[0007](1)将牡蛎去壳、去内脏团后，取剩余组织85
‑
95℃加热10～15min，以1:5g/mL～1:8g/mL的料液比加入蒸馏水匀浆；
[0008](2)碱溶酸沉方法提取牡蛎蛋白，碱溶条件为向牡蛎匀浆液中加入NaOH调节pH至10.0～11.0，磁力搅拌1～3h，离心取上清液，酸沉条件为用HCl调节pH至5.0～5.4，离心取蛋白沉淀；
[0009](3)将步骤(2)得到的蛋白沉淀以1:2g/mL
‑
1:4g/mL的料液比加入蒸馏水匀浆得到匀浆液，再向匀浆液中加入胃蛋白酶酶解，再经胰蛋白酶和风味蛋白酶双酶二次酶解，全程采用间歇式低频超声场辅助酶解；
[0010](4)将步骤(3)最终酶解液经100℃加热10～15min灭酶处理，4500～6000r/min离心30～50min后取上清液；
[0011](5)过滤步骤(4)所得的上清液采用纳滤膜截留分子量500～1000Da的分子，收集滤液，冻干后得多肽粉。
[0012]作为本专利技术的优选方案，步骤(2)具体为：使用NaOH调节pH至10.0～11.0，间歇式匀浆5～8min，4～8℃条件下磁力搅拌2～3h；然后4～8℃条件下，采用8000～10000r/min，离心15～20min后取上清液；使用HCl调节pH至5.0～5.4，4～8℃条件下，采用8000～10000r/min再离心15～20min后取沉淀；
[0013]作为本专利技术的优选方案，步骤(3)中：加入胃蛋白酶酶解，保持蛋白溶液的pH值为1.5～2.0，酶解时间为2～4h，酶解温度36～38℃，胃蛋白酶加入量为蛋白溶液中蛋白质含量的2.5～3.5wt％，后加入胰蛋白酶和风味蛋白双酶二次酶解，保持匀浆液的pH值为8.0～9.0，酶解时间为4～8h，酶解温度36～38℃，胰蛋白酶加入量为蛋白溶液中蛋白质含量的2.5～3.5wt％(，风味蛋白酶加入量为蛋白溶液中蛋白质含量的0.3～0.8wt％，胃蛋白酶的活力1500～2500U/g，胰蛋白酶酶活力为50000～80000U/g，风味蛋白酶酶活力为30000～50000U/g。
[0014]作为本专利技术的优选方案，步骤(3)中低频超声方法为：酶解全程采用间歇式低频超声场超声，超声频率为40、60、80kHz同步超声，超声功率为10～15W，超声方式为：一个超声周期内，然后超声30～50s，间歇60～80s，重复上述超声周期至酶解完成。
[0015]本专利技术还提供了一种上述方法制备得到的牡蛎肽。
[0016]本专利技术还提供了上述牡蛎肽在制备降脂功能的药物或制剂中的应用。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0018](1)本专利技术通过低功率超声辅助酶解，使得其酶的利用率显著提高，多肽得率提高了11.78％，水解度提高了15.60％，大大降低了生产成本。
[0019](2)本专利技术制备得到的牡蛎多肽，其减脂的功能大幅提升。且制得的多肽具有蛋白含量高、分子量小、易于吸收、胃肠道环境中稳定、得率高等优势。
附图说明
[0020]图1为本专利技术的生产工艺流程图。
[0021]图2为牡蛎肽对小鼠体重、肝脏和附睾脂肪重量的影响。
[0022]图3为牡蛎肽对小鼠肝脏组织结构的影响。
[0023]图4为牡蛎肽对小鼠血清生化指标的影响。
[0024]图5为牡蛎肽小鼠肝脏脂肪合成相关基因SREBP
‑
1c、ACC1表达的影响。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施方式对本专利技术做进一步阐述和说明。所述实施例仅是本公开内容的示范且不圈定限制范围。本专利技术中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
[0026]如无特别说明，本专利技术中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
[0027]多肽得率计算
[0028][0029]蛋白水解率测定
[0030]将含量为0.1％(w/w)2,4,6
‑
三硝基苯磺酸(TNBS)试剂溶解到水里。所有未消化样品、消化样品和标准溶液均在0.1％(w/w)SDS中溶解。在试管中2.0mL浓度为0.2125M磷酸钠缓冲液，pH8.2，再加入0.25mL的相同浓度的样品或标准溶液。每个离心管中加入2.0mL TNBS试剂，然后振荡器进行混合并在50℃下避光水浴孵化在60min。覆盖孵育后，每管加入4.0mL 0.1M HCl终止反应。然后在室温下冷却30min，最后用分光光度计在340nm测量吸光度值。按下式计算蛋白水解率：
[0031][0032]AN1：未消化的基质的含氮量；
[0033]AN2：消化后样品中基质的含氮量；
[0034]Npb：基质蛋白中肽键的含氮量。单位为mg/g蛋白。
[0035本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低频超声场辅助酶解制备降脂牡蛎肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将牡蛎去壳、去内脏团后，取剩余组织85
‑
95℃加热10～15min，以1:5g/mL～1:8g/mL的料液比加入蒸馏水匀浆；(2)碱溶酸沉方法提取牡蛎蛋白，碱溶条件为向牡蛎匀浆液中加入NaOH调节pH至10.0～11.0，磁力搅拌1～3h，离心取上清液，酸沉条件为用HCl调节pH至5.0～5.4，离心取蛋白沉淀；(3)将步骤(2)得到的蛋白沉淀以1:2g/mL
‑
1:4g/mL的料液比加入蒸馏水匀浆得到蛋白溶液，再向蛋白溶液中加入胃蛋白酶酶解，再经胰蛋白酶和风味蛋白酶双酶二次酶解，全程采用间歇式低频超声场辅助酶解；(4)将步骤(3)最终酶解液经100℃加热10～15min灭酶处理，4500～6000r/min离心30～50min后取上清液；(5)过滤步骤(4)所得的上清液采用纳滤膜截留分子量500～1000Da的分子，收集滤液，冻干后得多肽粉。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体为：使用NaOH调节pH至10.0～11.0，间歇式匀浆5～8min，4～8℃条件下磁力搅拌2～3h；然后4～8℃条件下，采用8000～10000r/min，离心15～20min后取上清液；...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈慧，董浠婷，刘书来，相兴伟，周梦圆，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：