一种免疫调节肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种免疫调节肽及其制备方法与应用，属于生物技术领域。本发明专利技术方法包括如下步骤：棘胸蛙去除骨和内脏，取肉并清水洗净，切碎匀浆，得到棘胸蛙肉样品；将棘胸蛙肉样品与水混合，均质，加入蛋白酶进行酶解，得到酶解液；将酶解液中的蛋白酶灭活，终止酶解反应，离心，收集上清液，经过浓缩和冷冻干燥后获得免疫调节肽。本发明专利技术提供的棘胸蛙肉免疫调节肽具有发挥免疫活性的氨基酸组成基础，且表现出良好的细胞免疫活性，包括细胞增殖活性、吞噬能力和细胞因子分泌能力。本发明专利技术免疫调节肽可为潜在的免疫调节剂提供了一种新的原材料，可进一步用于开发功能性食品。进一步用于开发功能性食品。进一步用于开发功能性食品。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫调节肽及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于属于生物
，具体涉及一种免疫调节肽及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]随着年龄的增长，人们不得不面对各种免疫缺陷疾病和免疫功能低下问题，这也使得免疫增强类药物的研究迫在眉睫，目前一些免疫增强类药物如咪喹莫特和左旋咪唑已经在临床上得到了应用。一方面，这些免疫增强类药物在一定程度上可以提高患者的免疫力，降低疾病感染的风险并辅助自身免疫病的治疗。另一放面，其副作用和经济成本也给人们带来不少的担忧。从天然成分中开发的具有免疫活性的提取物成为近年来研究的热点。如Jinyang Cai等从人β
‑
酪蛋白中提取分离的衍生肽BCCY
‑
1能够促进巨噬细胞的增殖以及激活信号通路(NF
‑
κB和MAPK)发挥免疫调节作用。家蚕蛹蛋白水解物中分离纯化鉴定出低分子量多肽(DHAV)可以促进脾细胞的增殖以及刺激相关免疫因子的表达(IL
‑
6和IL
‑
12、NF
‑
κB、细胞周期蛋白D1等)。除了动物来源的提取物外，一些植物来源的提取物也表现出良好的免疫调节活性。如从富硒大米蛋白水解产物中筛选出来的免疫调节含硒肽具有良好的免疫活性，能够促进巨噬细胞增殖、吞噬和分泌NO。
[0003]棘胸蛙(Rana spinosa)，又名石蛙、石鸡等，属两栖类无尾目(Anura)，广泛分布于中国的江苏、浙江等地区。棘胸蛙肉质厚嫩、富含多种营养物质，蛙肉中含有蛋白质、葡萄糖、氨基酸、铁、磷和维生素等多种营养成分，被视为山泉中的“活人参”，是一种极具药、食两用价值的良好资源，具有滋补强身、解热毒、治疳疾等功效。同时棘胸蛙具有潜在的免疫活性，董宝娟等采用基因克隆技术从棘胸蛙皮中获得具有抗菌功能的多肽；叶圣涛等发现养殖的棘胸蛙和野生的棘胸蛙都能提高血细胞吞噬活力、胃溶菌酶活力和抗氧化能力。此外，一些两栖蛙类中获得提取物具有免疫调节活性，如从林蛙皮肤、林蛙骨肉和林蛙油中获得多种免疫活性成分，能够促进RAW264.7巨噬细胞发挥免疫活性。然而，棘胸蛙作为一种药用价值和经济价值的天然动物资源，目前的研究主要集中在养殖技术的研究，鲜有对棘胸蛙深加工和生物活性的报道。

技术实现思路

[0004]为解决相关问题，本专利技术的首要目的在于提供一种免疫调节肽的制备方法。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的免疫调节肽。
[0006]本专利技术的再一目的在于提供上述免疫调节肽的应用。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]一种免疫调节肽的制备方法，包括如下步骤：
[0009]S1、棘胸蛙去除骨和内脏，取肉并清水洗净，切碎匀浆，得到棘胸蛙肉样品；
[0010]S2、将棘胸蛙肉样品与水混合，均质，加入蛋白酶进行酶解，得到酶解液；
[0011]所采用的蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶中的任意一种或多种，酶解条件为：温度35～55℃，pH 6～8，酶解时间2～4h，酶底比0.1～
0.5％；
[0012]优选地，所采用的酶为中性蛋白酶，酶解条件为：温度38～42℃，pH 6.5～7.5，酶解时间2～3h，酶底比0.2～0.4％；
[0013]更最优选地，所采用的酶为中性蛋白酶，酶解条件为：温度40℃，pH 7.18～7.2，酶解时间2.45～2.5h，酶底比0.38～0.4％。
[0014]S3、将酶解液中的蛋白酶灭活，终止酶解反应，离心，收集上清液，经过浓缩和冷冻干燥后获得棘胸蛙肉免疫调节肽。
[0015]优选的，步骤S1中调节pH所用的试剂为0.1mol/mL的NaOH溶液和HCl溶液。
[0016]优选的，步骤S3中使蛋白酶灭活的方式为将酶解液置于沸水浴中水浴，时间为10
±
2min。
[0017]优选的，步骤S3中离心的条件为4000
±
500r/min、30
±
5min。
[0018]优选的，步骤S3中获得棘胸蛙肉免疫调节肽后，冷冻备用，冷冻的温度为
‑
20
±
5℃。
[0019]一种免疫调节肽，通过上述制备方法制备得到。
[0020]上述免疫调节肽在下述至少一种情况中的应用：
[0021](1)在提升巨噬细胞吞噬能力中的应用；
[0022](2)在制备巨噬细胞吞噬能力促进剂中的应用；
[0023](3)在促进巨噬细胞增殖中的应用；
[0024](4)在制备巨噬细胞增殖促进剂中的应用；
[0025](5)在提升巨噬细胞NO释放、IL
‑
6和/或TNF
‑
α分泌量中的应用；
[0026](6)在制备巨噬细胞NO释放、IL
‑
6和/或TNF
‑
α分泌促进剂中的应用；
[0027](7)在制备提升生物免疫力的药物中的应用；
[0028](8)在制备提升生物免疫力的食品配料中的应用。
[0029]优选的，在应用中，所述的免疫调节肽的浓度为100～2000μg/mL。
[0030]更优选的，在应用中，所述的免疫调节肽的浓度为1000～2000μg/mL。
[0031]优选的，在应用中，所述的免疫调节肽的作用时间为20～30h。
[0032]更优选的，在应用中，所述的免疫调节肽的作用时间为24h。
[0033]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0034]本专利技术以棘胸蛙肉为研究对象，以RAW 264.7巨噬细胞增殖率为评价指标，通过蛋白酶筛选、单因素实验和响应面试验，优化棘胸蛙肉酶解工艺。此外测定棘胸蛙肉免疫调节肽的氨基酸组成，并测定RAW264.7巨噬细胞增殖率、细胞形态、吞噬能力、NO释放及细胞因分泌能力等指标，对其进行细胞免疫活性分析。结果显示明：最佳酶解条件为中性蛋白酶酶解2.5h，温度40℃，pH7.2，酶底比0.4％，所得酶解物的RAW 264.7巨噬细胞的细胞增殖率为47.06％。棘胸蛙肉酶解物富含多种必需氨基酸(34.091％)和疏水性氨基酸(32.932％)。棘胸蛙肉免疫调节肽对细胞增殖、吞噬能力、NO释放和细胞因子分泌均有显著效果，在100
‑
2000μg/mL浓度下显著高于对照组，在2000μg/mL时细胞增殖率达到222.09％，吞噬能力为211.89％，NO释放量为20.914pg/mL，TNF
‑
α和IL
‑
6的分泌量分别为1001.45pg/mL和650.242pg/mL。
[0035]本专利技术提供的棘胸蛙肉免疫调节肽具有发挥免疫活性的氨基酸组成基础，且表现
出良好的细胞免疫活性(细胞增殖活性、吞噬能力和细胞因子分泌能力)。本专利技术棘胸蛙肉免疫调本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种免疫调节肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、棘胸蛙去除骨和内脏，取肉并清水洗净，切碎匀浆，得到棘胸蛙肉样品；S2、将棘胸蛙肉样品与水混合，均质，加入蛋白酶进行酶解，得到酶解液；所采用的蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶中的任意一种或多种，酶解条件为：温度35～55℃，pH 6～8，酶解时间2～4h，酶底比0.1～0.5％；S3、将酶解液中的蛋白酶灭活，终止酶解反应，离心，收集上清液，经过浓缩和冷冻干燥后获得所述的免疫调节肽。2.根据权利要求1所述的免疫调节肽的制备方法，其特征在于：所采用的酶为中性蛋白酶，酶解条件为：温度38～42℃，pH 6.5～7.5，酶解时间2～3h，酶底比0.2～0.4％。3.根据权利要求1所述的免疫调节肽的制备方法，其特征在于：所采用的酶为中性蛋白酶，酶解条件为：温度40℃，pH 7.18～7.2，酶解时间2.45～2.5h，酶底比0.38～0.4％。4.根据权利要求1～3任一项所述的免疫调节肽的制备方法，其特征在于：步骤S1中调节pH所用的试剂为0.1mol/mL的NaOH溶液和HCl溶液。5.根据权利要求1～3任一项所述的免疫调节肽的制备方法，其特征在于：步骤S3中使蛋白酶灭活的方式为将酶解液置于沸水浴中水浴，时间为10
±
2min；步骤S3中离心的条件为4000
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【专利技术属性】
技术研发人员：苗建银，曾艳，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：