制备沉默NKG2A基因的NK细胞的方法及其用途技术

本发明专利技术提出了一种sgRNA分子和制备沉默NKG2A基因的NK细胞的方法。所述sgRNA分子包括：具有如SEQ ID NO：1～3所示的核苷酸序列中的至少之一；所述方法包括将前述的sgRNA分子以及编码Cas9分子的核酸引入NK细胞。该sgRNA分子可靶向敲低NK细胞中的NKG2A基因，获得沉默NKG2A基因的NK细胞，该沉默NKG2A基因的NK细胞具有肿瘤细胞杀伤活性强和IFN

【技术实现步骤摘要】
制备沉默NKG2A基因的NK细胞的方法及其用途


[0001]本专利技术属于生物
，具体地，本专利技术涉及一种制备沉默NKG2A基因的NK细胞的方法及其用途，更具体地，本专利技术涉及一种sgRNA分子、表达载体、试剂盒、CRISPR/Cas9系统、药物组合物、改造细胞的方法、制备沉默NKG2A基因的NK细胞的方法及其用途。

技术介绍

[0002]近年来，免疫治疗在肿瘤治疗领域取得了令人瞩目的进展，尤其是以抗CTLA
‑
4和抗PD
‑
1或PD
‑
L1抗体为代表的免疫卡控点阻断疗法，通过阻断T细胞表面抑制性受体与其配体的结合，阻断抑制性信号的传递，纠正免疫抑制性微环境所介导的免疫抑制，恢复肿瘤微环境T细胞的抗肿瘤能力，在多种转移性晚期癌症(包括转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等)治疗方面取得了较高的应答率，使众多原本已经失去治疗机会的对放化疗无效的晚期癌症患者有了重新治疗的希望。
[0003]然而，并非所有的恶性肿瘤患者对PD
‑
1或PD
‑
L1或CTLA
‑
4阻断治疗有效，对PD
‑
1或PD
‑
L1抗体治疗的应答率只有20％左右，改善临床响应及克服耐药机制是该领域面临的挑战。因此，探究肿瘤对免疫卡控阻断治疗不应答的机制，寻找其他影响免疫细胞功能的免疫调控卡点，成为肿瘤免疫治疗领域亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供了一种制备沉默NKG2A基因的NK细胞的方法，该方法制备的NK细胞。
[0005]本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：
[0006]自然杀伤细胞(NK细胞)位于机体抗癌的第一道防线，是识别杀伤肿瘤的“天然职业杀手”，具有应答迅速和泛特异性识别的特点，在肿瘤细胞发生变异的早期可迅速识别并启动对肿瘤细胞的杀伤。NK细胞具有杀伤谱广、反应速度快、副作用小、潜在风险较低、细胞来源广泛等优势，因此，基于NK细胞的肿瘤免疫治疗已成为细胞免疫治疗研发领域的热点，已开展多项NK细胞过继免疫治疗用于各种血液瘤和实体肿瘤的临床试验治疗。然而，NK细胞治疗实体瘤面临的难题之一是NK细胞容易受肿瘤免疫抑制微环境影响。
[0007]NKG2A作为一个重要的免疫卡控点，主要表达在NK细胞表面，在NKT细胞和某些CD8+T细胞亚群亦有表达。NKG2A与CD94以异源二聚体的形式表达在细胞表面，主要识别非经典MHC
‑
I类分子HLA
‑
E，向NK细胞传递抑制性信号，抑制NK细胞的效应功能，即为肿瘤微环境高表达的NKG2A会削弱NK细胞的活化和抗肿瘤功能。而目前逆转肿瘤微环境导致免疫细胞耗竭的方法通常是制备针对免疫检查点分子的单克隆抗体(又称免疫检查点阻断疗法)，如采用抗NKG2A抗体阻断NKG2A与其配体的结合而恢复NK细胞的功能来唤醒强大的抗肿瘤免疫。但是，临床上免疫检查点阻断疗法的应答率偏低，只有20％
‑
30％，且容易产生耐药。
[0008]基于此，专利技术人在试验过程中发现，采用本专利技术的sgRNA分子靶向沉默NK细胞的NKG2A基因的编辑效率较高，且获得的沉默NKG2A基因的NK细胞可直接阻断或取消其与配体
HLA
‑
E的结合，该NK细胞具有肿瘤杀伤活性强和IFN
‑
γ分泌能力强等优点，可有效抑制肿瘤生长和延长小鼠的生存期。
[0009]在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种sgRNA分子。根据本专利技术的实施例，所述sgRNA分子包括：具有如SEQ ID NO：1～3所示的核苷酸序列中的至少之一。根据本专利技术实施例的sgRNA分子可靶向敲低细胞(尤其是NK细胞)中的NKG2A基因，尤其是可靶向沉默NK细胞的NKG2A基因，获得沉默NKG2A基因的NK细胞，该沉默NKG2A基因的NK细胞具有肿瘤细胞杀伤活性强和IFN
‑
γ分泌能力强等优点，可有效抑制肿瘤的生长和延长小鼠的生存期，可用于消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制或者用于预防和/或治疗肿瘤或癌症。并且，专利技术人经过实验意外发现，该sgRNA分子的应用还可以进一步降低细胞(尤其是NK细胞)PD
‑
1和Tim
‑
3等其他抑制性受体的表达，从而可进一步消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制，以及预防和/或治疗肿瘤或癌症。
[0010]GAAGCTCATTGTTGGGATCC(SEQ ID NO：1)；
[0011]AACAACTATCGTTACCACAG(SEQ ID NO：2)；
[0012]TGAACAGGAAATAACCTATG(SEQ ID NO：3)。
[0013]在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种表达载体。根据本专利技术的实施例，所述表达载体携带前所述的sgRNA分子。根据本专利技术实施例的表达载体可靶向敲低细胞中的NKG2A基因，尤其是可靶向沉默NK细胞的NKG2A基因，获得沉默NKG2A基因的NK细胞，该沉默NKG2A基因的NK细胞具有肿瘤细胞杀伤活性强和IFN
‑
γ分泌能力强等优点，可有效抑制肿瘤的生长和延长小鼠的生存期，可用于消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制或者用于预防和/或治疗肿瘤或癌症。并且，专利技术人经过实验意外发现，该sgRNA分子的应用还可进一步降低细胞(尤其是NK细胞)PD
‑
1和Tim
‑
3等其他抑制性受体的表达，从而可进一步消除或减轻肿瘤的免疫逃脱机制，以及预防和/或治疗肿瘤或癌症。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述表达载体进一步包括编码Cas9分子的核酸。
[0015]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种试剂盒。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒5包括：前述的sgRNA分子或前述的表达载体。由前所述，sgRNA分子和表达载体可靶向
[0016]敲低细胞(尤其是NK细胞)中的NKG2A基因，以及可降低细胞(尤其是NK细胞)表面PD
‑
1和Tim
‑
3等其他抑制性受体的表达。由此，采用包含前述sgRNA分子和表达载体的试剂盒，可用于制备沉默NKG2A基因的细胞(尤其是NK细胞)，以及用于进一步降低细胞(尤其是NK细胞)PD
‑
1和Tim
‑
3等其他抑制性受体的表达。
[0017]0根据本专利技术的实施例，所述试剂盒进一步包括编码Cas9分子的核酸。
[0018]在本专利技术的又一方面，本专利技术提出了一种CRISPR/Cas9系统。根据本专利技术的实施例，所述CRISPR/Cas9系统包括：前述的sgRNA分子。由前所述，sgRNA分子可靶向敲低细胞(尤其是NK细胞)中的NKG2A基因，由此，采用包含前述sgRNA分子的CRISPR/Cas9
[0019]系统可靶向沉默细胞(尤其是NK细胞)的NKG2A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种sgRNA分子，其特征在于，包括：具有如SEQ ID NO：1～3所示的核苷酸序列中的至少之一。2.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求1所述的sgRNA分子以及任选地编码Cas9分子的核酸。3.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的sgRNA分子或权利要求2所述的表达载体；以及任选地编码Cas9分子的核酸。4.一种CRISPR/Cas9系统，其特征在于，包括：权利要求1所述的sgRNA分子和任选地编码Cas9分子的核酸。5.一种药物组合物，其特征在于，包括：权利要求1所述的sgRNA分子或权利要求2所述的表达载体；以及任选地药学上可接受的载体或辅料；任选地编码Cas9分子的核酸。6.一种改造细胞的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的sgRNA分子以及编码Cas9分子的核酸引入待改造细胞。7.一种制备沉默NKG2A基因的NK细胞的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的sgRNA分子以及编码Cas9分子的核酸引入NK细胞。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彩，胡渊，陈敏华，王烃，伏永玲，
申请(专利权)人：上海恩凯细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：