杜氏肌营养不良症相关的外显子剪接增强子、sgRNA及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种杜氏肌营养不良症相关的外显子剪接增强子、sgRNA及应用，提供的sgRNA能够诱导人类DMD热点区(外显子2

【技术实现步骤摘要】
杜氏肌营养不良症相关的外显子剪接增强子、sgRNA及应用


[0001]本专利技术属于基因治疗领域，涉及一种杜氏肌营养不良症相关sgRNA在人IPS细胞中针对基因突变型遗传性疾病DMD致病突变的改造治疗。

技术介绍

[0002]杜氏肌营养不良症(DMD)是一种X染色体隐性遗传疾病，在男性新生儿中发病率为1/5000，伴随着肌肉的损伤和坏死，患者不仅要依靠轮椅生活，最终会死于呼吸以及心脏功能障碍，平均寿命大约在20岁。杜氏肌营养不良症的发生是由于编码抗肌萎缩蛋白的基因突变使其编码的mRNA开放阅读框发生移码或是产生了提前的终止密码子，导致抗肌萎缩蛋白的完全缺失，导致了DMD的表型。在传统的治疗手段中，一般采用抗炎药物(如皮质类固醇)降低肌肉周围的炎症反应，从而延缓肌肉坏死；或是利用血管紧张素抑制剂来缓解心肌功能退化所带来的不适，这类药物包括配哚普利、以及多种洛尔类beta受体阻断剂。但是这些都无法从根本上治疗DMD，延长DMD病人的寿命。随着分子生物学的不断进展，结合临床的数据分析，人们发现有一类同样在Dystrophin蛋白的编码基因中存在突变的病人，并没有表现出与DMD病人一样的严重病理进程，这类病人被称为贝氏肌营养不良症BMD患者，他们所携带的Dystrophin基因突变不会造成完整蛋白open reading frame的破坏，因此可以产生具有一定生物学功能的Dystrophin蛋白，不会表现出严重的心肌功能障碍以及其他肌肉功能的缺陷。相对于DMD病人的严重病理进程，BMD病人的寿命不会受到明显的影响，可以几乎恢复如正常人一般的日常生活，因此，将DMD转变为BMD的治疗策略被提出。目前已有许多针对DMD的特效药上市：其中包括Sarepta公司研发的Eteplirsen(针对Exon51跳读)以及Golodirsen(针对Exon53跳读)，其本质是一种反义寡聚核苷(ASO)，能够作用于目的外显子pre
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mRNA上，诱导目的外显子跳读，上述两种药物分别可以治疗13％以及8％的DMD患者，然而这些目前已经上市的药物往往存在治疗效率低，需要持续给药，价格极其昂贵的缺点。而基因编辑治疗方案则是可以直接对基因突变型遗传病的致病突变进行靶向改造，一旦经过编辑，即可从根本上达到治愈疾病的效果，具有极大的优势。不仅如此，对于其他类型的DMD患者的治疗仍处于较为初步的研究阶段，为了尽可能大范围的适应不同DMD患者的治疗需求，针对诱导突变热点区(外显子2
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20以及外显子45
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55)之间的其他外显子跳读的研究也十分迫切。据研究统计单独诱导DMD第53号外显子以及45号外显子跳读能够分别治疗8.1％，7.7％的DMD患者；针对单独诱导DMD突变热点区的其他外显子例如第4号外显子，第5号外显子，第46号外显子，第47号外显子，第49号外显子以及第52号外显子的跳读分别对应可治疗的DMD患者分别为0.2％，0.3％，4.3％，0.3％，0.02％以及4.1％(Theoretic Applicability of Antisense
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Mediated Exon Skipping for Duchenne Muscular Dystrophy Mutations，2009；Correction of diverse muscular dystrophy mutations in human engineered heart muscle by single
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site genome editing，2017)。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于针对杜氏肌营养不良症的治疗，提供一类杜氏肌营养不良症相关外显子剪接增强子，sgRNA，作为药物用以哺乳动物(疾病动物模型以及人类病人)体内基因编辑治疗。
[0004]第一方面，本专利技术提供了一种杜氏肌营养不良症相关的外显子剪接增强子，所述外显子剪接增强子为靶向人类DMD基因Exon53的外显子剪接增强子元件，其核苷酸序列包括：
[0005]1)如SEQ ID N0.14所示的序列及其反向互补序列。
[0006]2)如SEQ ID N0.15所示的序列及其反向互补序列。
[0007]通过改变或者阻断上述外显子剪接增强子(Exon Splicing Enhancer，ESE)等元件，可以诱导跳读DMD基因Exon51，从而实现对哺乳动物体内基因编辑治疗。
[0008]第二方面，本专利技术提供了一种杜氏肌营养不良症相关的可以靶向特定基因组的单链向导RNA(single
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strand guide RNA，sgRNA)，所述sgRNA的序列包括：
[0009]针对人类DMD基因Exon4的sgRNA(Sg E4
‑5’
SS)，其核苷酸序列为：CATTATTGTTCTGCAAAACC(SEQ ID NO.1)；
[0010]针对人类DMD基因Exon5的sgRNA
‑
1(Sg E5
‑3’
SS)，其核苷酸序列为：TAAATCAACCTGTTAAAGAA(SEQ ID NO.2)；
[0011]针对人类DMD基因Exon5的sgRNA
‑
2(Sg E5
‑5’
SS)，其核苷酸序列为：CCTGCCAGTGGAGGATTATATT(SEQ ID NO.3)；
[0012]针对人类DMD基因Exon45的sgRNA(Sg E45
‑3’
SS)，其核苷酸序列为：GTTCCTGTAAGATACCAAAA(SEQ ID NO.4)；
[0013]针对人类DMD基因Exon46的sgRNA(Sg E46
‑3’
SS)，其核苷酸序列为：TTCTTCTAGCCTGGAGAAAG(SEQ ID NO.5)；
[0014]针对人类DMD基因Exon47的sgRNA(Sg E47
‑3’
SS)，其核苷酸序列为：TCCACCAGTAACTGAAACAG(SEQ ID NO.6)；
[0015]针对人类DMD基因Exon49的sgRNA
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1(Sg E49
‑3’
SS)，其核苷酸序列为：TTCCTGGGGAAAAGAACCCA(SEQ ID NO.7)；
[0016]针对人类DMD基因Exon49的sgRNA
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2(Sg E49
‑5’
SS)，其核苷酸序列为：TTACCTTCACTGGCTGAGTG(SEQ ID NO.8)；
[0017]针对人类DMD基因Exon52的sgRNA
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1(Sg E52
‑3’
SS)，其核苷酸序列为：GCCTGTAAGAACAAATATCC(SEQ ID NO.9)；
[0018]针对人类DMD基因Exon53的sgRNA
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1(S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杜氏肌营养不良症相关的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的序列包括：针对人类DMD基因Exon4的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；针对人类DMD基因Exon5的sgRNA
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1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；针对人类DMD基因Exon5的sgRNA
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2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；针对人类DMD基因Exon45的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；针对人类DMD基因Exon46的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；针对人类DMD基因Exon47的sgRNA
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1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；针对人类DMD基因Exon49的sgRNA
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1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；针对人类DMD基因Ex...

【专利技术属性】
技术研发人员：常兴，邱晗，李甲，
申请(专利权)人：西湖大学，
类型：发明
国别省市：