一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术提供了一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA，是针对水禽源ARV的L2基因保守序列设计得到。经试验证实可知，所述外源性人工miRNA不仅能够抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制及增殖，而且能够作为一种新的基因治疗手段，应用于抗水禽源禽呼肠孤病毒新型药物的研制，同时也可以用于水禽源禽呼肠孤病毒致病机制的研究以及转基因动物的制备，从而减少水禽源禽呼肠孤病毒对养禽业造成的经济损失。成的经济损失。成的经济损失。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA及其应用。

技术介绍

[0002]禽呼肠孤病毒(ARV)是一种分节段的双股RNA病毒，属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)。ARV是全世界家禽疾病中最为重要的病原之一，ARV宿主广泛，能感染包括鸡鸭鹅在内的多种禽类，既能引发病毒性关节炎、发育迟缓综合征、腱鞘炎、运动障碍和跛足、脾炎、肝炎、心外膜炎等疾病，又能引起宿主免疫抑制，加剧其他病原的感染，是一类既可水平传播也能垂直传播的禽传染性疾病，可导致禽类养殖业巨额经济损失。
[0003]ARV基因组为线性分节段双链RNA(dsRNA)，大小约为23kb。根据电泳迁移率的不同，可将ARV的基因组分为L、M、S三组，共10个片段，ARV基因组可按节段大小分为大(L1～L3)、中(M1～M3)、小(S1～S4)三类，它们至少编码8种结构蛋白和4种非结构蛋白。通过对ARV所有基因节段构建遗传进化树分析，除了M2外，鸡源毒株和水禽源毒株分别形成两个独立的分支。
[0004]目前，国内外市场上已有多种ARV弱毒疫苗和灭活疫苗应用于ARV的预防，ARV毒株S1133和1733被用作灭活疫苗，而减毒活疫苗S1133被认为是最安全的可用疫苗之一，并被广泛使用。但临床上ARV的发生率仍居高不下，ARV的流行范围、流行趋势不断扩大，新出现的流行变异株也给ARV的防控带来更大的挑战。此外，ARV的基因型、血清型呈现多样性，不同血清型之间交叉保护作用不理想，随着ARV不断进化，传统疫苗对新出现的流行毒株保护效果不佳。并且S1133和1733毒株均属于鸡源ARV，与水禽ARV不属于一个分支，对水禽源呼肠孤病毒感染的保护作用较弱。目前只有针对番鸭ARV的CA株疫苗在市售，其针对其他水禽源ARV的保护作用有待考量。因此，探索新的针对该病的预防与控制技术具有较大的科学意义与应用价值。
[0005]RNAi作为生物机体古老而天然的细胞防御机制，特异性地降解细胞内与之同源序列，可令生物产生对内源寄生性核酸或外源病原体的致病性核酸的抵抗，同时还可调节细胞内编码基因的表达水平，自然被广泛地应用于抗病毒研究中，并取得了较大的进展，其可以特异地抑制病毒的生命周期中的各个阶段，包括病毒基因组的复制、转录、装配、出芽等。而amiRNA(artificial microRNA，amiRNA)由基于天然初级miRNA(pri
‑
miRNA)的靶特异性siRNA插入物和支架组成。siRNA是在转录物中寻找互补序列的指南，而pri
‑
miRNA支架确保了正确的加工和运输。细胞中siRNA成熟和siRNA水平的动态类似于内源性miRNAs的动态，因此，amiRNA比其他RNAi方式更安全。因此，如何利用miRNA解决水禽源ARV防疫困难的技术问题显得很有必要。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA，能够抑制水禽源禽呼肠孤病毒的复制及增殖。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA，所述外源性人工miRNA为双链核苷酸amiRNA
‑
420、amiRNA
‑
1107、amiRNA
‑
1979或amiRNA
‑
2863中的任意一种；
[0009]所述双链核苷酸amiRNA
‑
420的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；
[0010]所述双链核苷酸amiRNA
‑
1107的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.3～4所示；
[0011]所述双链核苷酸amiRNA
‑
1979的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.5～6所示；
[0012]所述双链核苷酸amiRNA
‑
2863的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.7～8所示。
[0013]优选的，所述外源性人工miRNA根据水禽源禽呼肠孤病毒的L2基因设计得到。
[0014]本专利技术提供了一种表达质粒，所述表达质粒包含上述外源性人工miRNA。
[0015]优选的，所述表达质粒的基础载体为pcDNA
TM
6.2
‑
GW/EmGFP
‑
miR载体。
[0016]本专利技术提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述的外源性人工miRNA。
[0017]优选的，所述外源性人工miRNA为药物组合物中的活性成分。
[0018]本专利技术还提供了上述的外源性人工miRNA或上述的表达质粒在制备治疗水禽源禽呼肠孤病毒药物中的应用。
[0019]本专利技术还提供了上述的外源性人工miRNA或上述的表达质粒在制备治疗水禽源禽呼肠孤病毒生物制剂中的应用。
[0020]本专利技术还提供了上述的外源性人工miRNA或上述的表达质粒在制备抗禽呼肠孤病毒转基因细胞系中的应用。
[0021]本专利技术还提供了上述的外源性人工miRNA或上述的表达质粒在制备抗禽呼肠孤病毒转基因水禽中的应用。
[0022]本专利技术的有益效果：
[0023]本专利技术提供了一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA，其是针对水禽源ARV L2基因的保守序列设计人工miRNA，用人工miRNA表达载体转染Vero细胞，在优化转染效率的基础上，经50％组织细胞感染剂量(TCID
50
)以及real
‑
time PCR检测人工miRNA对病毒基因及其复制的抑制效果，从而筛选能有效抑制水禽源ARV的人工miRNA。本专利技术所述的外源性人工miRNA对水禽源ARV的复制和增殖具有良好的抑制效果，不仅可作为抗水禽源ARV的新型生物制剂进行开发，而且可用于抗病水禽品系培育，具有良好的应用前景。
附图说明
[0024]图1为人工miRNA表达载体结构示意图。
[0025]图2为人工miRNA转染48h时的转染效率；其中，A为amiRNA
‑
420，B为amiRNA
‑
902，C
为amiRNA
‑
1000，D为amiRNA
‑
1107，E为amiRNA
‑
1433，F为amiRNA
‑
1835，G为amiRNA
‑
1979，H为amiRNA
‑
2222，I为amiRNA
‑
2303，J为amiRNA
‑
2774，K为amiRNA
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA，其特征在于，所述外源性人工miRNA为双链核苷酸amiRNA
‑
420、amiRNA
‑
1107、amiRNA
‑
1979或amiRNA
‑
2863中的任意一种；所述双链核苷酸amiRNA
‑
420的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；所述双链核苷酸amiRNA
‑
1107的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.3～4所示；所述双链核苷酸amiRNA
‑
1979的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.5～6所示；所述双链核苷酸amiRNA
‑
2863的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.7～8所示。2.根据权利要求1所述的外源性人工miRNA，其特征在于，所述外源性人工miRNA根据水禽源禽呼肠孤病毒的L2基因设计得到。3.一种表达质粒，其特征在于，所述表达质粒包含权利要求1或2所述外源性人工miRNA。4.根据权利要求3所述的表达质粒，其特征在于，所述表达质粒的基础载体为p...

【专利技术属性】
技术研发人员：金文杰，钱金涵，朱亭帆，秦爱建，邵红霞，羊扬，闫彩虹，叶建强，钱琨，王倩倩，邓建中，王建，郑建高，金松，洪枫，王培永，张文成，卞红春，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：