一种重组氧化葡萄糖酸杆菌的构建及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种重组氧化葡萄糖酸杆菌的构建及其应用，属于基因工程和全细胞催化领域。本发明专利技术通过在氧化葡萄糖酸杆菌中异源表达来源于鞘氨醇单胞菌的环氧化物水解酶，同时利用氧化葡萄糖酸杆菌自身膜结合的醇、醛脱氢酶，以环氧苯乙烷为底物一步法合成R

【技术实现步骤摘要】
一种重组氧化葡萄糖酸杆菌的构建及其应用


[0001]本专利技术涉及一种重组氧化葡萄糖酸杆菌的构建及其应用，属于基因工程和全细胞催化


技术介绍

[0002](R)
‑
扁桃酸(Mandelic acid)，简称R
‑
MA，是制备许多手性药物的重要中间体，包括抗肿瘤、抗肥胖剂、头孢菌素和半合成青霉素等抗生素，在化学和制药工业中至关重要。目前，R
‑
MA主要通过化学法合成，而化学合成条件苛刻且副产物多，环境污染严重。相反，生物合成法则具有反应条件温和，立体选择性高、对环境友好等优点，是生产R
‑
MA的一种极具潜力的替代方法。然而，R
‑
MA的生物生产仍面临许多挑战，包括缺乏合适的催化剂和宿主菌株进行有效的合成反应。
[0003]高价值天然和非天然化合物的生物制造的关键是从廉价且易于获得的底物开发绿色、高效和有前景的合成路线。环氧化物主要来自于易于获得的石油基副产品，在制备药物和精细化学品中有广泛的应用。使用廉价的环氧苯乙烷为底物生产R
‑
MA应用潜力巨大。环氧苯乙烷可通过环氧化物水解酶水解为R
‑1‑
苯基
‑
1，2
‑
乙二醇(R
‑
PEG)，之后被进一步氧化脱氢生成R
‑
MA。Li Zhi等人报道了一种来源于天蓝色链霉菌的糖醇氧化酶可将R
‑
PEG直接氧化成R
‑
MA，但转化24h，R
‑
MA产量仅为2.43g/L，糖醇氧化酶的低表达量和酶活力可能是催化效率差的主要原因。
[0004]氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)是属于醋酸杆菌属的革兰氏阴性菌，作为食品安全性菌株，因其强大的膜结合的醇、醛脱氢酶赋予的不完全氧化多种糖、醇合成对应酮或酸的能力而闻名，目前已成功应用于生产维生素C、二羟基丙酮、葡萄糖酸和米格列醇等化合物的生产中，此外，G.oxydans细胞还可用于催化R
‑
PEG氧化合成R
‑
MA。在氧化葡萄糖酸杆菌细胞的催化过程中，反应通常利用其膜结合的脱氢酶而发生在周质空间中，因而绝大多数底物的转化和产物的释放不需要进出细胞膜，大大提高了生物合成效率。因此，我们选择G.oxydans作为宿主细胞来构建用于从氧化苯乙烯生产R
‑
MA的催化系统，这就需要将环氧化物水解酶在氧化葡萄糖酸杆菌中进行异源表达。在酶催化等生物合成过程中，启动子对于控制基因调控和蛋白质表达至关重要，然而，强启动子缺乏仍然是氧化葡萄糖酸杆菌621H基因工程中的限制因素，此开发内源性组成型强启动子对于氧化葡萄糖酸杆菌至关重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种利用环氧苯乙烷合成R
‑
扁桃酸重组氧化葡萄糖酸杆菌的构建，从而解决现有技术对于以环氧苯乙烷为底物合成R
‑
扁桃酸存在的催化效率差、产量低的问题，同时提供了一种氧化葡萄糖酸杆菌内源性组成型强启动子的筛选方法，以解决氧化葡萄糖酸杆菌缺乏自身可用基因工程手段的缺陷。
[0006]本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种提高环氧化物水解酶表达量的启动子，所述启动子为P
02805
、P
09400
、P
04650
、P
12780
、P
04000
、P
04750
或P
10190
；所述启动子P
02805
、P
09400
、P
04650
、P
12780
、P
04000
、P
04750
、P
10190
的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
[0008]本专利技术提供了一种筛选上述强启动子的方法，所述方法具体步骤如下：
[0009](1)对氧化葡萄糖酸杆菌进行转录组分析，挑选转录组结果中FPKM值排在前十位的基因起始密码子前500bp左右的核苷酸片段作为启动子区域。
[0010](2)将启动子序列于绿色荧光蛋白进行融合PCR，连接到pBBR1MCS
‑
2质粒上，构建重组载体pBBR1MCS
‑2‑
Promoter
‑
eGFP。
[0011](3)将重组质粒点转化到氧化葡萄糖酸杆菌中，测定荧光强度。强度高于pBBR1MCS
‑
2质粒上的P
lac
的启动子认定为强启动子。
[0012](4)将强启动子序列与环氧化物水解酶基因片段融合连接在pBBR1MCS
‑
2质粒上，构建重组载体pBBR1MCS
‑2‑
Promoter
‑
SpEH。
[0013](5)将上述重组质粒电转化到氧化葡萄糖酸杆菌中，测定环氧化物水解酶的表达量和酶活，获得环氧化物水解酶的最适表达的强启动子。
[0014]本专利技术还提供了一种合成R
‑
扁桃酸的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，所述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌以氧化葡萄糖酸杆菌621H为宿主细胞，采用所述启动子P
02805
、P
09400
、P
04650
、P
12780
、P
04000
、P
04750
或P
10190
过表达了鞘氨醇单胞菌来源的环氧化物水解酶；所述启动子P
02805
、P
09400
、P
04650
、P
12780
、P
04000
、P
04750
、P
10190
的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述启动子为P
12780
。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述环氧化物水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌是以pBBR1MCS
‑
2质粒为表达载体。
[0018]本专利技术还提供了一种制备环氧化物水解酶的方法，所述方法为，将上述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌接种至培养基中，进行发酵，制备得到环氧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高环氧化物水解酶表达量的启动子，其特征在于，所述启动子为P
02805
、P
09400
、P
04650
、P
12780
、P
04000
、P
04750
或P
10190
；所述启动子P
02805
、P
09400
、P
04650
、P
12780
、P
04000
、P
04750
、P
10190
的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。2.一种合成R
‑
扁桃酸的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌以氧化葡萄糖酸杆菌621H为宿主细胞，采用权利要求1所述的启动子过表达了鞘氨醇单胞菌来源的环氧化物水解酶。3.根据权利要求2所述的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，其特征在于，所述启动子为P
12780
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张显，饶志明，刘菲，陈妍，杨套伟，徐美娟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：