基于牛β防御素5的结核疫苗及其在预防结核病中的应用制造技术

本发明专利技术提供了基于牛β防御素5的结核疫苗及其在预防结核病中的应用，所述结核疫苗包含结核菌AH抗原和牛β防御素5的融合蛋白或其编码序列。本发明专利技术通过将结核分枝杆菌表面优势抗原Ag85A和HspX以及牛β防御素5优化序列后进行融合表达，纯化后的蛋白与聚肌胞混合制成融合蛋白疫苗AHB

【技术实现步骤摘要】
基于牛
β
防御素5的结核疫苗及其在预防结核病中的应用


[0001]本申请属于动物疾病免疫和疫苗领域，具体地，本申请提供了基于牛β防御素5的结核疫苗及其在预防结核病中的应用。

技术介绍

[0002]结核病(Tuberculosis，TB)由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC)引起，其中最主要的两种病原体为结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，M.bovis)。主要由Mtb引起的 TB给全球人类健康造成巨大的危害，每年100万以上的人因Mtb而死亡。由M.bovis引起的牛结核(bovine tuberculosis,bTB)是一种对全球人类健康和养殖业发展有重大影响的人兽共患病，不但给养殖业造成严重的经济损失，还对人类的健康造成威胁，在一些国家或地区，3.1％
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30.2％的TB病人由M.bovis感染引起。bTB被世界动物卫生组织(WorldOrganization for Animal Health，OIE)列入B类动物疾病，被我国农业部门列入二类动物疫病。目前对人类TB的控制措施是在婴幼儿时期接种卡介苗(Bacille Calmette
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Guerin， BCG)，但BCG仅对儿童有效，对成年人无效。对bTB的控制则采取“诊断
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扑杀”的方式进行净化根除处理，然而，这一措施成本高，在发展中国家难以实施。尽管人们经过上百年的努力来控制TB，但至今结核病形势依然严峻，严重影响人类健康和养殖业发展。
[0003]将宿主的免疫调节活性分子设计到结核疫苗中已有报道，如鼠β防御素2，细胞因子 IL
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12和巨噬细胞集落因子等，主要用于DNA疫苗设计中。但将牛β防御素5应用到结核疫苗的研究尚未见报道。我们前期研究发现呼吸道黏膜牛β防御素5(B5)能促进疫苗诱导的特异性免疫应，增强机体抵抗M.bovis感染的免疫调节作用(专利号：CN202110285747.6)。但B5在毕赤酵母菌和大肠杆菌中表达量低，我们设计的疫苗将用于靶动物牛，牛为大型动物，使用量大，B5的低表达不利于后续的临床应用。

技术实现思路

[0004]针对以上问题，申请人进一步将将结核菌抗原AH和B5进行融合表达设计了两种疫苗，即融合蛋白疫苗AHB
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P和融合DNA疫苗pVAX1
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AHB，其中，pVAX1
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AHB疫苗不需要额外添加佐剂，大大降低了疫苗制备成本，而且实际研究证实了AHB
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P和pVAX1
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AHB经呼吸道黏膜免疫可预防结核感染。
[0005]一方面，本申请提供了一种结核疫苗，所述结核疫苗包含结核菌AH抗原和牛β防御素 5的融合蛋白AHB。
[0006]进一步地，所述融合蛋白AHB由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码；优选地，所述结核疫苗中还包含疫苗中还包括聚肌胞(poly I:C)。
[0007]一方面，本申请提供了一种结核疫苗，所述结核疫苗包含pVAX1
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AHB构建体，所述构建体中包括编码结核菌AH抗原和牛β防御素5的核酸。
[0008]进一步地，所述构建体包含序列为SEQ ID NO.2的核酸以及载体pVAX1。
[0009]进一步地，所述疫苗中还包含佐剂和/或辅料。
[0010]进一步地，所述包含pVAX1
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AHB构建体的结核疫苗中不包含佐剂。
[0011]进一步地，所述疫苗为经黏膜使用的疫苗。
[0012]进一步地，所述疫苗为经呼吸道黏膜使用的疫苗。
[0013]进一步地，所述疫苗为经鼻黏膜使用的疫苗。
[0014]进一步地，本申请提供了上述疫苗在制备预防或治疗牛分枝杆菌(Mycobacterium bovi) 所导致的疾病中的应用
[0015]进一步地，所述牛分枝杆菌(Mycobacterium bovi)所导致的疾病为牛结核病。
[0016]本申请中所述的牛β防御素5也称为β
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defensin
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5、B5或简写为B；本申请中所述的牛β防御素5序列不限于实施例中实际制备时所用序列，其他已知和未知的天然和人工的变体也可以使用。本申请中所述的AH抗原为由Ag85A和HspX经过各种方式连接而成的抗原，本申请中所述的Ag85A和HspX序列不限于实施例中实际制备时所用序列，其他已知和未知的天然和人工的变体也可以使用。
[0017]本申请中的黏膜疫苗可以为通过口腔、鼻、胃、上呼吸道黏膜等施用的疫苗，优选通过鼻黏膜施用的疫苗。
[0018]本申请的佐剂包含各种本领域已知和在研的用于增强免疫效果的佐剂，包括但不限于矿物质类佐剂、油乳类佐剂、微生物类佐剂。
附图说明
[0019]图1：AHB的纯化和鉴定：(A)AHB的纯化；(B)AHB的western blot鉴定；(C)pVAX1
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AHB 表达鉴定；
[0020]图2A和图2B：疫苗对肺脏产生AH特异性IFN
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γ或IL
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17的CD4
+
T细胞的影响；***p <0.0001；
[0021]图3：疫苗的保护作用评价：(A)左肺HE染色切片扫描；(B)肺炎性面积百分比；(C和 D)肺和脾的细菌载量；*p<0.033,**p<0.0021,***p<0.0002。
具体实施方式
[0022]实施例1融合疫苗的制备
[0023]融合基因序列的密码子优化
[0024](1)AHB
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P融合蛋白疫苗的AHB序列根据大肠杆菌偏好的密码子进行优化，优化后的基因序列如下：
[0025][0026](2)pVAX1
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AHB融合DNA疫苗的AHB序列根据牛(Bos taurus)偏好的密码子进行优化，优化后的基因序列如下：
[0027][0028]AHB融合蛋白的制备
[0029]AHB基因序列两端加入酶切位点5'(KpnI)和3'(BamHI)，通过双酶切连接到原核表达载体pET
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30a(+)，并转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，用含卡那霉素(50μg/mL)的 LB培养基培养细菌至对数生长期(OD
600nm
为0.6
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0.8)，加入1mM的IPTG，37℃摇床，160rpm，诱导表达4h，4℃，8000rpm离心3min收集菌体，并用预冷PBS洗两遍，菌体冻存于
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80℃用于后续纯化。
[0030]解冻菌体，用预冷PBS重悬(200毫升菌液沉淀加入20毫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结核疫苗，其特征在于，所述结核疫苗包含结核菌AH抗原和牛β防御素5的融合蛋白AHB。2.根据权利要求1所述的结核疫苗，其中所述融合蛋白AHB由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列编码；优选地，所述结核疫苗中还包含疫苗中还包括聚肌胞(poly I:C)。3.一种结核疫苗，其特征在于，所述结核疫苗包含pVAX1
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AHB构建体，所述构建体中包括编码结核菌AH抗原和牛β防御素5的核酸。4.根据权利要求3所述的结核疫苗，其中所述构建体包含序列为SEQ ID NO.2的核酸以及载体pVAX1。5.根据权利要求1
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4任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：周向梅，梁正敏，葛昕，王元智，刘一朵，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：