高效生产L-高苯丙氨酸的方法及一种产L-高苯丙氨酸的菌株技术

本发明专利技术公开了一种高效生产L

【技术实现步骤摘要】
高效生产L
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高苯丙氨酸的方法及一种产L
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高苯丙氨酸的菌株


[0001]本专利技术涉及一种高效生产L
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高苯丙氨酸的方法及一种产L
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高苯丙氨酸的菌株，属于生物工程


技术介绍

[0002]L
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高苯丙氨酸(L
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HPA)主要是血管紧张素转换酶抑制剂的主要合成原料，当前，世界上大概有20种用于医治高血压的新药的共同中间体是L
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HPA。包括依那普利、贝那普利、西拉普利、咪达普利、喹那普利等。另外，L
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HPA还是蛋白酶抑制剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、中性内肽酶抑制剂和β
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内酰胺抗生素等手性药物的重要组成部分。
[0003]目前，L
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HPA的主要生产方法为化学合成法。以N
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邻苯二甲酰
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L
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天冬氨酸酐为原料，经傅克反应，氢化还原，脱保护等过程合成L
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HPA，但是这种方法收率较低，能耗却较大，同时会对环境产生毒害作用，不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。通过生物酶法制备L
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HPA具有产品质量稳定安全、工艺条件温和、高效、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，因此迫切需要一种有效的生物法高效生产L
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HPA。
[0004]目前，生物酶法生产L
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HPA的主要方法有：(1)脱氢酶法。Yao Nie等在大肠杆菌中异源表达苯丙氨酸脱氢酶突变体和葡萄糖脱氢酶，利用OPBA(2
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氧代
‑4‑
苯基丁酸)作为底物，以游离的铵根离子作为氨基供体合成L
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HPA。通过分批补料策略，1.08M的OPBA经过四次分批补料转化为L
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HPA，转化率为90.2％。Lirong Yang等通过半理性设计对谷氨酸脱氢酶进行酶改造，I406F突变体对底物OPBA的比活力提高了30.1倍，底物投料量为17.5g/L的情况下，产量达到17.13g/L，转化率为99％。(2)转氨酶法。Byung
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Kwan Cho等通过芳香族氨基酸转氨酶(AroAT)，以OPBA作为底物，L
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天冬氨酸为氨基供体生产L
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HPA，其转化率>97％。(3)海因酶法。Wen
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Hwei Hsu等以D,L型苯乙基海因混合物通过海因外消旋酶得到L
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HPAH，随后通过海因酶获得氨甲酰
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L
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高苯丙氨酸，最后通过氨甲酰水解酶得到L
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HPA，转化率达到49％。
[0005]在现有的L
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HPA的生物合成途径中，尽管取得了一定的成果，但是其所利用的底物包括OPBA、苯乙基海因等价格昂贵且难以获得，比L
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HPA的价格高，这是极不利于工业化生产。为了实现从廉价起始原料合成L
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HPA，前期的研究工作中，我们开发了一条利用廉价的甘氨酸和苯乙醛为原料，利用共表达苏氨酸醛缩酶，苏氨酸脱氨酶，苯丙氨酸脱氢酶，和甲酸脱氢酶的大肠杆菌工程菌株生产L
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HPA，但产量仅有1.226g/L，转化率仅为34.2％，这限制了工业化应用，因此，我们开发了其他利用廉价原料合成L
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HPA的合成路线来实现L
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HPA的工业化生产。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术设计了一条以廉价的苯甲醛和丙酮酸为原料，利用级联酶法合成L
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高苯丙氨酸的新路线，首先通过醛缩酶催化的羟醛缩合反应生成(E)2
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氧代
‑4‑
苯基
‑3‑
丁烯酸，随后利用醌氧化还原酶催化的C＝C双键还原生成2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁
酸，最终利用苯丙氨酸脱氢酶催化的还原胺化生成L
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高苯丙氨酸，在此过程中，利用甲酸脱氢酶进行NADH的再生。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种高效生产L
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高苯丙氨酸的方法，所述方法是以苯甲醛和丙酮酸为底物，采用醛缩酶(PpNahE)、醌氧化还原酶(EcQOR)、苯丙氨酸脱氢酶(TiPheDH)和甲酸脱氢酶(CbFDH)进行级联酶反应，催化底物生成L
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高苯丙氨酸。
[0008]在本专利技术中，首先通过醛缩酶催化的羟醛缩合反应生成(E)2
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氧代
‑4‑
苯基
‑3‑
丁烯酸，随后利用醌氧化还原酶催化的C＝C双键还原生成2
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氧代
‑4‑
苯基丁酸，最终利用苯丙氨酸脱氢酶催化的还原胺化生成L
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高苯丙氨酸，在此过程中，利用甲酸脱氢酶进行NADH的再生。
[0009]进一步地，所述醛缩酶(PpNahE)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述醌氧化还原酶(EcQOR)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述苯丙氨酸脱氢酶(TiPheDH)氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10所示；所述甲酸脱氢酶(CbFDH)氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0010]在本专利技术中，进一步对苯丙氨酸脱氢酶进行了突变，获得了氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的苯丙氨酸脱氢酶突变体，L
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高苯丙氨酸转化率更高。
[0011]进一步地，所述的醛缩酶、醌氧化还原酶、苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达在同一株宿主菌中或分别表达在不同株宿主菌中。
[0012]本专利技术的第二个目的是提供一种产L
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高苯丙氨酸的基因工程菌，所述的基因工程菌共表达醛缩酶(PpNahE)、醌氧化还原酶(EcQOR)、苯丙氨酸脱氢酶(TiPheDH)和甲酸脱氢酶(CbFDH)。
[0013]进一步地，所述醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述醌氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述苯丙氨酸脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10所示；所述甲酸脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0014]进一步地，所述的基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。
[0015]进一步地，所述的大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)。
[0016]进一步地，所述的醛缩酶和醌氧化还原酶以pCDFDuet
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1为载体进行表达，所述的苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶以pRSFDuet
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1为载体进行表达。
[0017]本专利技术的第三个目的是提供所述的基因工程菌在生产L
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效生产L
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高苯丙氨酸的方法，其特征在于，所述方法是以苯甲醛和丙酮酸为底物，采用醛缩酶、醌氧化还原酶、苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶进行级联酶反应，催化底物生成L
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高苯丙氨酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述醌氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述苯丙氨酸脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10所示；所述甲酸脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的醛缩酶、醌氧化还原酶、苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达在同一株宿主菌中或分别表达在不同株宿主菌中。4.一种产L
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高苯丙氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌共表达醛缩酶、醌氧化还原酶、苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶。5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述醛缩酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述醌氧化还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述苯丙氨酸脱氢酶氨基酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10所示；所述甲酸脱氢酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，高登科，宋伟，吴静，刘佳，陈修来，高聪，郭亮，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：