一种多酶级联催化L-氨基酸生成N-甲基-L-氨基酸的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种多酶级联催化L

【技术实现步骤摘要】
一种多酶级联催化L
‑
氨基酸生成N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸的方法及其应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，特别涉及一种多酶级联催化L
‑
氨基酸生成N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸的方法及其应用。

技术介绍

[0002]N
‑
α
‑
烷基化是调节手性α
‑
氨基酸活性的一种机制。N
‑
甲基
‑
α
‑
氨基酸在制药和精细化工等领域应用广泛，是制备多种生物活性分子的重要组成部分，如抗生素万古霉素、免疫抑制剂环孢素、细胞抑制放线菌素和铁载体需氧蛋白等。因此，对N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸的合成方法进行研究具有重要价值。
[0003]与其他手性化合物相似，N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸的制备方法主要分为化学合成法和生物合成法。化学合成法依赖于N
‑
烷基化过程或还原胺化过程。这些合成路线通常需要使用有毒试剂和危险溶剂，如自燃金属氢化物或有基因毒性的烷基化剂，反应过程中会产生大量污染环境的废物，有些反应还需要特殊的温度和压力环境，并且部分方法获得的产物纯度较低，需要复杂的后处理程序。
[0004]随着生物技术的发展，生物法制备N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸越来越受到人们的关注。生物法合成N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸具有绿色清洁、反应条件温和以及转化率高的优势。目前的合成方法包括利用N
‑
甲基转移酶或几种脱氢酶。N
‑
甲基转移酶(EC2.1.1)在自然界中负责许多氨基酸、肽和蛋白质的N
‑
α
‑
甲基化，产生单甲基化、二甲基化或三甲基化产物，缺点在于这种酶通常对底物具有高度选择性，底物范围较窄。一些脱氢酶能催化α
‑
酮酸或亚胺与胺供体进行还原胺化反应产生N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸，包括Opines脱氢酶、N
‑
甲基氨基酸脱氢酶、酮亚胺还原酶和亚胺还原酶等。该类反应需要特定的底物，有些底物溶解度较差、价格昂贵，不适用于工业化的生产。

技术实现思路

[0005]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种多酶级联催化L
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氨基酸生成N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸的方法，该方法联合利用L
‑
氨基酸氧化酶和N
‑
甲基氨基酸脱氢酶，以天然L
‑
氨基酸为底物生成相应N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供所述多酶级联催化L
‑
氨基酸生成N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸的方法的应用。
[0007]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0008]一种多酶级联催化L
‑
氨基酸生成N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸的方法，是以L
‑
氨基酸为底物，利用L
‑
氨基酸氧化酶、N
‑
甲基氨基酸脱氢酶和NADPH再生酶同步级联催化L
‑
氨基酸反应生成N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸。
[0009]所述的L
‑
氨基酸包括L
‑
苯丙氨酸、L
‑
谷氨酸、L
‑
亮氨酸、L
‑
赖氨酸、L
‑
缬氨酸和L
‑
异亮氨酸中的至少一种；优选为L
‑
苯丙氨酸、L
‑
谷氨酸和L
‑
亮氨酸中的至少一种。
[0010]所述的N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸为N
‑
甲基
‑
L
‑
苯丙氨酸、N
‑
甲基
‑
L
‑
谷氨酸、N
‑
甲基
‑
L
‑
亮氨酸、高脯氨酸、N
‑
甲基
‑
L
‑
缬氨酸和N
‑
甲基
‑
L
‑
异亮氨酸中的至少一种；优选为N
‑
甲基
‑
L
‑
苯丙氨酸、N
‑
甲基
‑
L
‑
谷氨酸和N
‑
甲基
‑
L
‑
亮氨酸中的至少一种。
[0011]所述的L
‑
氨基酸氧化酶优选为祖先L
‑
氨基酸氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]所述的N
‑
甲基氨基酸脱氢酶优选为来源于恶臭假单胞菌的N
‑
甲基氨基酸脱氢酶，其氨基酸序列在NCBI的登陆号为AB190215.1。
[0013]所述的NADPH再生酶优选为来源于伯克霍尔德菌的甲酸脱氢酶，其氨基酸序列在NCBI的登陆号为ACF35003.1。
[0014]所述的L
‑
氨基酸氧化酶、N
‑
甲基氨基酸脱氢酶和NADPH再生酶均可以通过常规方法获得，如通过原核表达，经蛋白纯化获得。
[0015]所述的原核表达的宿主菌优选为大肠杆菌；更优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0016]所述的蛋白纯化可采用Ni柱亲和层析法进行纯化。
[0017]所述的反应的体系为pH 7.5～9.0的Tris
‑
HCl缓冲液体系或pH 9.5～10.0的Na2CO3‑
NaHCO3缓冲液体系；优选为pH 9.5～10.0的Na2CO3‑
NaHCO3缓冲液体系；更优选为pH 9.5的Na2CO3‑
NaHCO3缓冲液体系。
[0018]所述的反应的体系为：0.01～1mg/mL L
‑
氨基酸脱氨酶，1～5mg/mL N
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甲基氨基酸脱氢酶，0.2～1mg/mL NADPH再生酶，10～100mM L
‑
氨基酸，10～200mM胺供体，10～3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多酶级联催化L
‑
氨基酸生成N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸的方法，其特征在于：以L
‑
氨基酸为底物，利用L
‑
氨基酸氧化酶、N
‑
甲基氨基酸脱氢酶和NADPH再生酶同步级联催化L
‑
氨基酸反应生成N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的L
‑
氨基酸氧化酶为祖先L
‑
氨基酸氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的N
‑
甲基氨基酸脱氢酶为来源于恶臭假单胞菌的N
‑
甲基氨基酸脱氢酶，其氨基酸序列在NCBI的登陆号为AB190215.1；所述的NADPH再生酶为来源于伯克霍尔德菌的甲酸脱氢酶，其氨基酸序列在NCBI的登陆号为ACF35003.1。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的L
‑
氨基酸为L
‑
苯丙氨酸、L
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谷氨酸、L
‑
亮氨酸、L
‑
赖氨酸、L
‑
缬氨酸和L
‑
异亮氨酸中的至少一种；所述的N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸为N
‑
甲基
‑
L
‑
苯丙氨酸、N
‑
甲基
‑
L
‑
谷氨酸、N
‑
甲基
‑
L
‑
亮氨酸、高脯氨酸、N
‑
甲基
‑
L
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缬氨酸和N
‑
甲基
‑
L
‑
异亮氨酸中的至少一种；所述的反应的体系为pH 7.5～9.0的Tris
‑
HCl缓冲液体系或pH 9.5～10.0的Na2CO3‑
NaHCO3缓冲液体系。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的L
‑
氨基酸为L
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苯丙氨酸、L
‑
谷氨酸和L
‑
亮氨酸中的至少一种；所述的N
‑
甲基
‑
L
‑
氨基酸为N
‑
甲基
‑
L
‑
苯丙氨酸、N
‑
甲基
‑
L
‑
谷氨酸和N
‑
甲基
‑
L
‑
亮氨酸中的至少一种；所述的反应的体系为pH 9.5～10.0的Na2CO3‑
NaHCO3缓冲液体系。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的反应的体系为：0.01～1mg/mL L
‑
氨基酸脱氨酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄文勇，高胜寒，徐培，宗敏华，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：