一种L-酪氨酸的酶法合成方法技术

本发明专利技术公开了一种L

【技术实现步骤摘要】
一种L
‑
酪氨酸的酶法合成方法


[0001]本专利技术属于医药领域，具体涉及一种L
‑
酪氨酸的酶法合成方法。

技术介绍

[0002]氨基酸是构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态及生化活性，生物体内的各种蛋白质由20种L型氨基酸构成，其中L
‑
酪氨酸对人和动物的生长发育和新陈代谢起着重要作用。作为生化试剂，以及对经基肉桂酸、L
‑
多巴、对轻基苯乙烯等医药化工产品的制备原料，L
‑
酪氨酸被广泛应用在食品、饲料、医药和化工等行业。在农业科学研究中，L
‑
酪氨酸也被作为饲料添加剂配制人工昆虫饲料;在食品领域，L
‑
酪氨酸是一种重要的食品添加剂;在临床上，L
‑
酪氨酸还被用于研究生殖避孕疗效；在化妆品领域，L
‑
酪氨酸的盐类产品如L
‑
酪氨酸甲酯盐酸盐，可有效的缓解酪氨酸酶对酪氨酸的氧化作用，进而减少黑色素的生成;在医药领域，L
‑
酪氨酸是合成肾上腺素、甲状腺素、酪氨酸亚硫酸盐、左旋多巴等的前体原料，左旋多巴在体内转变为多巴胺，是目前治疗帕金森病的有效药物，酪氨酸亚硫酸盐用于治疗骨髓灰质炎、早老年性精神病、结核性脑膜炎的急性期等中枢神经系统疾病。
[0003]制备L
‑
酪氨酸方法有蛋白质水解物提取法、化学合成法、直接发酵法、酶转化法，酶转化法是通过酪氨酸酚裂解酶，催化丙酮酸或L
‑r/>丝氨酸、苯酚和氨酶法合成L
‑
酪氨酸。酶转化法避免了为保证产物的区域选择性或对映选择性而使用的复杂步骤，优点是反应条件温和，副反应少，收率较高，光学纯度高。
[0004]中国专利文献
“ꢀ
L
‑
酪氨酸或L
‑
酪氨酸衍生物酶法转化制备方法（专利申请号为CN201310289373.0）”公开了一种L
‑
酪氨酸或L
‑
酪氨酸衍生物酶法转化制备方法，其步骤为：（1）将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株在培养基中培养，产生高酶活酪氨酸酚裂解酶；（2）将酪氨酸酚裂解酶细胞或酶粗提液与含丙酮酸发酵液或含丙酮酸粗提液或丙酮酸盐粗品水溶液混合，再加入氨水、苯酚或邻苯二酚、磷酸吡哆醛和表面活性剂，在25
‑
55℃，pH7
‑
11条件下进行酶促反应，等电点结晶法分离制备转化产物L
‑
酪氨酸或L
‑
酪氨酸衍生物(L
‑3‑
羟基酪氨酸)。该专利技术利用酪氨酸酚裂解酶催化丙酮酸、氨、苯酚或邻苯二酚合成L
‑
酪氨酸或L
‑
酪氨酸衍生物(L
‑3‑
羟基酪氨酸)，酶法转化效率高，其中苯酚摩尔转化率达到95%以上，但是仍然存在有L
‑
酪氨酸产量待提高的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种L
‑
酪氨酸的酶法合成方法，以解决在中国专利文献“L
‑
酪氨酸或L
‑
酪氨酸衍生物酶法转化制备方法（专利申请号为CN201310289373.0）”公开的基础上，如何优化组分、用量、工艺等，从而提高L
‑
酪氨酸的产量的问题。
[0006]为了解决以上技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种L
‑
酪氨酸的酶法合成方法，包括以下步骤：S1：将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株在培养基中培养，产生含高酶活酪氨酸酚
裂解酶的培养液离心收集菌体；S2：以海藻酸锰与明胶作为复合载体，以CaCl2作为成型剂，取培养16h后的重组大肠E. coil BL21培养液离心收集菌体，然后添加9%的生理盐水制备成10%的菌液，菌液与海藻酸锰与明胶的混合液体按照（0.8
‑
1）:1的体积比进行混匀，将混匀好的菌悬液通过电子蠕动泵滴入到CaCl2溶液中形成凝胶球，将凝胶球于2
‑
4℃中静置，然后过滤，收集凝胶球以备用；S3：将收集好的具体细胞经步骤S2固定化后，将制备好的凝胶球按（1
‑
2）：（5
‑
10）的比例加入到提前制备好的20 mL的反应体系，用氨水调节反应液pH为8.0
‑
8.5，放置于温度为20
‑
25℃，转速为200
‑
250r/ min摇床中继续培养8
‑
16h，然后培养结束后添加10 mol/L的氢氧化钠溶解L
‑
酪氨酸；S4：采用高效液相色谱检测L
‑
酪氨酸的含量。
[0007]优选地，所述海藻酸锰与明胶的用量比为（0.8
‑
1.2）:（0.5
‑
1）。
[0008]优选地，所述海藻酸锰的浓度为0.3
‑
0.5%，明胶的浓度为0.5
‑
0.7%。
[0009]优选地，所述海藻酸锰中添加有浓度为0.6%的碳酸钙，海藻酸锰与碳酸钙的用量比为50:1。
[0010]优选地，所述步骤S2中菌液与海藻酸锰和明胶的混合液体按照0.9:1的体积比进行混匀。
[0011]优选地，所述步骤S2中凝胶球于3℃中静置4
‑
5h。
[0012]优选地，所述步骤S3中反应体系包含0.6
‑
0.65 mol/L的氯化按、0.07
‑
0.1 mol/L苯酚、0.08
‑
0.1 mol/L的丙酮酸钠、0.14
‑
0.16μmol/L的磷酸吡哆醛。
[0013]优选地，所述步骤S3中反应体系包含0.63 mol/L的氯化铵、0.08mol/L苯酚、0.09 mol/L的丙酮酸钠、0.15μmol/L的磷酸吡哆醛。
[0014]优选地，所述步骤S3中反应体系还包括表面活性剂。
[0015]优选地，所述表面活性剂为质量分数为0.1
‑
0.15%的吐温
‑
80。
[0016]本专利技术具有以下有益效果：（1）本专利技术在L
‑
酪氨酸的制备过程中添加海藻酸锰、明胶和吐温
‑
80，进而实现采用固定化细胞技术，利用微生物中所含的复合酶系进行催化反应，固定化细胞保持了没的原始状态以及稳定性，使反应速度加快，协同提高了L
‑
酪氨酸产量，这是因为：本专利技术利用海藻酸锰、明胶作为复合载体，氯化钙溶液的作用是使胶体聚沉，形成稳定的凝胶珠；海藻酸锰为海藻酸钙浸泡在硫酸锰液体中而得，海藻酸钙是天然凝胶，由海藻酸锰胶体溶液与氯化钙反应，即可得到海藻酸锰凝胶，海藻酸锰凝胶具有亲水性强，通透性能好，且锰离子能够提高固定化细胞的耐磷酸盐程度，即提高固定化细胞的稳定性。明胶是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种L
‑
酪氨酸的酶法合成方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株在培养基中培养，产生含高酶活酪氨酸酚裂解酶的培养液离心收集菌体；S2：以海藻酸锰与明胶作为复合载体，以CaCl2作为成型剂，取培养16h后的步骤S1中培养液离心收集菌体，然后添加9%的生理盐水制备成10%的菌液，菌液与海藻酸锰与明胶的混合液体按照（0.8
‑
1）:1的体积比进行混匀，将混匀好的菌悬液通过电子蠕动泵滴入到CaCl2溶液中形成凝胶球，将凝胶球于2
‑
4℃中静置，然后过滤，收集凝胶球以备用；S3：将收集好的具体细胞经步骤S2固定化后，将制备好的凝胶球按（1
‑
2）：（5
‑
10）的比例加入到提前制备好的20 mL的反应体系，用氨水调节反应液pH为8.0
‑
8.5，放置于温度为20
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25℃，转速为200
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250r/ min摇床中继续培养8
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16h，然后培养结束后添加10 mol/L的氢氧化钠溶解L
‑
酪氨酸；S4：采用高效液相色谱检测L
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酪氨酸的含量。2.根据权利要求1所述的L
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酪氨酸的酶法合成方法，其特征在于，所述海藻酸锰与明胶的用量比为（0.8
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1.2）:（0.5
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1）。3.根据权利要求1所述的L
‑
酪氨酸的酶法合成方法，其特征在于，所述海藻酸锰的浓度为0.3
‑
0.5%...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡少丽，黄平，赵恒，
申请(专利权)人：福州一诺维生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：