一种微生物发酵生产左旋多巴的方法及应用技术

本发明专利技术公开了通过微生物发酵生产左旋多巴的方法。该方法主要通过提高微生物中4

【技术实现步骤摘要】
一种微生物发酵生产左旋多巴的方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种高产左旋多巴基因工程大肠杆菌菌株及其构建方法，以及使用该菌株发酵生产左旋多巴的方法。本专利技术还涉及用于从发酵过程中回收左旋多巴的方法。属于医药、食品和饲料领域。

技术介绍

[0002]左旋多巴(L
‑
DOPA)，化学名称为：3
‑
羟基
‑
L
‑
酪氨酸。中文同义词：L
‑3‑
(3,4
‑
二羟基苯)丙氨酸；L
‑
B
‑
(3,4
‑
二羟基苯)丙氨酸；L
‑
β
‑
(3,4
‑
二羟基苯)丙氨酸；左多巴；3
‑
(3,4
‑
二羟苯)
‑
L
‑
丙氨酸；L
‑3‑
(3,4
‑
二羟苯基)丙氨酸。左旋多巴是一种白色或类白色结晶性粉末，易溶于稀酸，微溶于水，不溶于乙醇、乙醚或氯仿，无臭，无味，在空气中变黑。
[0003]左旋多巴是生物体内一种重要的生物活性物质，是从L
‑
酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。左旋多巴是治疗常见老年病
‑‑
帕金森病的主要药物。据统计，普通人群帕金森病的发病率为0.1％，60岁以上老人的发病率为1％，80岁以上的发病率为2％。随着人口老龄化速度的加快，对左旋多巴的需求将不断增加。
[0004]60年代末，国外一些学者开始致力于微生物酶法合成左旋多巴的研究。70年代初，日本学者Yamada等对微生物酶法合成左旋多巴进行了深入的研究，通过菌种选育及发酵条件的优化于1993年在味之素公司投入工业化生产。国内学者也先后开展了微生物法合成左旋多巴的研究，但至今开展工业化的报道不多。虽然现在国内有多家制药厂生产左旋多巴及其药剂，但大都是来自植物中提取或化学合成。
[0005]目前，左旋多巴的生产有化学合成、从天然植物中提取以及微生物酶转化法三条主要途径，各条生产途径的概述如下：
[0006]1、化学合成L
‑
DOPA
[0007]1911年人们首次利用3，4
‑
碳酰二氧苯甲醛为原料化学合成多巴，后来人们还利用胡椒醛、香草醛、儿茶酚、酪氨酸来合成L
‑
DOPA。国内还有人用D
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麻黄碱拆分N
‑
乙酰
‑3‑
(3，4
‑
二甲氧基苯)
‑
DL
‑
丙氨酸来合成L
‑
DOPA。虽用化学法合成多巴的途径有许多，但遇到一个主要的困难是合成出来的产品是D
‑
型和L
‑
型的混合物，将二者分开较困难，工艺复杂。由于L
‑
DOPA会引起毒性反应，因此医学上需控制它的旋光度。
[0008]2、从植物中提取L
‑
DOPA
[0009]植物中的天然DOPA都是L
‑
型的。1913年就有人从蚕豆籽苗种豆荚中提取天然L
‑
DOPA，1949年从野生植物藜豆中提取L
‑
DOPA。国内于1972年从豆科植物藜豆种子中提取L
‑
DOPA获得成功，1974年商品L
‑
DOPA投放市场。目前主要从猫豆中提取。从植物中提取L
‑
DOPA的缺点是受到原料来源的限制，产量小，质量以及产品收率低，生产成本高，产量不稳定。
[0010]3、利用微生物酶转化法合成L
‑
DOPA
[0011]90年代初人们开始运用基因工程的手段获取酪氨酸酚解酶(TPL)的基因片段，然后连接到不同的载体中让其在宿主细胞中高效表达。Kurusu.Y等人构建了pGRY30
‑
TPL1质粒，此质粒含有来自大肠杆菌的酪氨酸酚解酶(I)基因。后来有学者构建了pHTD I质粒，能
高效地表达产生酪氨酸酚解酶；从C freundii中提取出TPL基因并构建质粒；对Erwinia herbicola AJ2982的TPL基因克隆到E.coli中进行表达，再将培养的细胞转入多巴合成体系中，反应30h后，反应液中多巴含量为105mM(20.7mg/ml)。利用微生物酶生物转化法生产左旋多巴，较化学合成、猫豆提取方法，具有生产成本低、工艺相对比较简单等优点，但仍然存在起始原料用量大、原料残留的问题。

技术实现思路

[0012]本专利技术针对左旋多巴的代谢途径，采用新的遗传修饰方法改造微生物，并利用该微生物以更高效率和更高产量生产左旋多巴。
[0013]具体而言，本专利技术通过提高微生物中4
‑
羟苯乙酸3
‑
单加氧酶B(hpaB)的作用，增加葡萄糖代谢流，大大提高L
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DOPA发酵生产产量。
[0014]根据本专利技术的一个实施方案，本专利技术涉及一种通过微生物发酵生产左旋多巴的方法，该方法包括：
[0015]A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种能提高微生物中4
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羟苯乙酸3
‑
单加氧酶B(hpaB)作用的遗传修饰；和
[0016]B)收集从培养步骤A)中产生的左旋多巴。
[0017]在本专利技术中，提高微生物中4
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羟苯乙酸3
‑
单加氧酶B(hpaB)作用的遗传修饰选自a)微生物中4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)的酶活性增加；和/或b)微生物中4
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羟苯乙酸3
‑
单加氧酶B(hpaB)被过量表达；
[0018]本领域技术人员可以理解，为提高微生物中4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)的作用，可以通过筛选编码具有4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)的酶活性增加的基因突变体来实现。筛选hpaB基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中hpaB的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达hpaB来实现。
[0019]在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
[0020]在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码4
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羟苯乙酸3
‑
单加氧酶B(hpaB)的核酸序列的重组核酸分子转化。
[0021]在一个方面，编码4
‑
羟苯乙本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过微生物发酵生产左旋多巴的方法，该方法包括：A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种能提高微生物中4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)作用的遗传修饰；和B)收集从培养步骤A)中产生的左旋多巴。2.如权利要求1所述的方法，其中，提高微生物中4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)作用的遗传修饰选自a)微生物中4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)的酶活性增加；和/或b)微生物中4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。3.如权利要求2所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)的核酸序列的重组核酸分子转化；优选，编码4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)的核酸序列含有至少一种增加4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)的酶活性的遗传修饰；进一步优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQ ID NO：3的下述位置处的取代中的一种或多种：第123位半胱氨酸被甘氨酸取代、第295位甘氨酸被天冬氨酸取代和第323位丝氨酸被脯氨酸取代；更优选，编码4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)的核酸序列为SEQ ID NO：2；优选，所述的4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约30％相同，优选至少约50％相同，进一步优选至少约70％相同，进一步优选至少约80％相同，更进一步优选至少约90％相同，最优选至少约95％相同的氨基酸序列，其中所述的4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)具有酶活性；进一步优选，所述的4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列；进一步优选，重组核酸分子中编码4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)的基因拷贝数增加；进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子；优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。4.如权利要求2所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)的基因的内源性天然启动子的遗传修饰；优选，编码4
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羟苯乙酸3
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单加氧酶B(hpaB)的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换；进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中，重组核酸分子被装入质粒中或重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。6.如权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中，所述重组核酸分子的表达是可诱导的；优选，所述重组核酸分子的表达可由乳糖诱导。7.如权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中，所述培养步骤A)在约20℃
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约45℃进行；优选，在约33℃
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约37℃进行；优选，所述培养步骤A)在约pH4.5
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约pH8.5进行；优选在约pH6.7
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约pH7.2进行；优选，所述培养步骤A)采用常规发酵培养基；
进一步优选，发酵培养基中包含碳源；进一步优选，发酵培养基中包含氮源。进一步优选，发酵培养基中包含碳源和氮源；进一步优选，发酵培养基中包含碳...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹季虹，
申请(专利权)人：南京寿柏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：