一种微生物发酵生产色氨酸的方法及应用技术

本发明专利技术公开了通过微生物发酵生产色氨酸的方法。该方法主要通过提高微生物中磷酸解酮酶的作用，以更高效率和更高产量生产色氨酸。以更高效率和更高产量生产色氨酸。以更高效率和更高产量生产色氨酸。

【技术实现步骤摘要】
一种微生物发酵生产色氨酸的方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种高产色氨酸基因工程大肠杆菌菌株及其构建方法，以及使用该菌株发酵生产色氨酸的方法。本专利技术还涉及用于从发酵过程中回收色氨酸的方法。属于医药、食品和饲料领域。

技术介绍

[0002]色氨酸，又名β
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吲哚
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α
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氨基丙酸，是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸。色氨酸有三种光学异构体，L
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色氨酸呈绢丝光泽、六角片状白色晶体，无臭，有甜味。L
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色氨酸在水中溶解度低(1.14g/l，25℃)，溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中易分解。L
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色氨酸微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。
[0003]色氨酸具有重要的生理作用。在生物体内，从L
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色氨酸出发可合成激素、色素、生物碱、辅酶和多种生理活性物质。在临床上常用作氨基酸输液、抗闷剂、抗臭滤药，调节脑代谢等。新近的研究报导，L
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色氨酸在体内能在维生素B6参与下，生成神经荷尔蒙的前体5
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羟基色胺，从而促进睡眠和精神安定，可用作保健食品和安神药。
[0004]色氨酸的生产方法，最早主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是随着研究的不断深入，微生物法生产色氨酸的方法已经走向实用，并且处于主导地位。微生物法大体上可以分为直接发酵法、微生物转化法、酶法，以及将直接发酵法与化学合成法相结合、直接发酵法与转化法相结合生产色氨酸。
[0005](1)微生物转化法：亦称前体发酵法。这种方法使用葡萄糖作为碳源，同时添加合成色氨酸所需的前体物如邻氨基苯甲酸、吲哚等，利用微生物的色氨酸合成酶系来合成色氨酸。这种方法同直接发酵法一样，需要解除生物合成途径中大部分酶的反馈调节，以使色氨酸能够高浓度蓄积。另外，所添加的前体物大都是抑制微生物生长的，因此添加量不可过高，一般采取分批少量添加的方法。同时可以筛选前体物的抗性突变株来提高前体物的添加量。微生物转化法的缺点是，当转化液中前体物浓度较高时，转化率下降。另外，前体物的价格比较昂贵，不利于降低成本。
[0006](2)酶法：酶法是利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生产色氨酸。这些酶包括色氨酸酶、色氨酸合成酶、丝氨酸消旋酶等。根据提供这些酶的微生物种类数，可以分为双酶菌法和单酶菌法两种类型。该法既可以直接加入细胞壁溶解酶使细胞破壁后再使用，也可以将所需的酶固定化后再使用，一般由酶源菌体的培养、菌体的分离洗涤、固定化和反应几个阶段组成。例如，利用大肠杆菌的色氨酸合成酶和恶臭假单孢菌的丝氨酸消旋酶，以吲哚和DL
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丝氨酸为底物；或者利用黄杆菌的酶系，以DL
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吲哚甲基乙丙酚脲为底物，同时在反应液中加入适量的苯肼或野芝麻花碱以抑制色氨酸氧化酶的活性而阻止色氨酸的降解。酶法能够利用化工合成的前体物为原料，具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少、精制操作容易的优点，但生产成本高。
[0007](3)直接发酵法：该法是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的色氨酸生产菌种来生产色氨酸。对这种方法的研究比较早，但在相当长的一段时间内达不到工
业化生产的要求。主要原因是从葡萄糖到色氨酸的生物合成途径比较漫长，其代谢流也比较弱，而且色氨酸的合成需要多种前体物，若想进一步提高色氨酸的积累量就必需设法增强合成这些前体物的代谢流。另一方面，色氨酸生物合成途径中的调控机制比较复杂，除了反馈调节这一粗调系统之外，还存在着细调系统－弱化子系统。随着重组DNA技术在微生物育种中的应用，为优良的色氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供了可靠的技术保障，使微生物直接发酵法生产色氨酸成为一种廉价的工业化生产方法。采用微生物直接发酵法生产L
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色氨酸，显著优于微生物转化法和酶法，生产成本低廉，具有显著的优势。
[0008]在微生物以葡萄糖作为碳源的分解代谢过程中，磷酸解酮酶(phosphoketolase)催化果糖
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6磷酸生成4
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磷酸
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赤藓糖和乙酰磷酸，以及催化5
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磷酸
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木酮糖生成乙酰磷酸和3
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磷酸甘油醛，生成的乙酰磷酸经磷酸转乙酰酶生成乙酰辅酶A进入三羧酸循环。这一代谢支路避免糖酵解途径中由丙酮酸脱羧生成乙酰辅酶A时释放的一分子CO2，可以提高葡萄糖的利用率。
[0009]由于磷酸乙酮醇酶途径仅发生在双歧杆菌糖代谢，在大肠杆菌中是不存在的。可在大肠杆菌等微生物中引入该途径，用以绕过由丙酮酸转化为乙酰CoA的途径，避免了丙酮酸转化为乙酰CoA时释放CO2而产生的碳损失，也即葡萄糖的损失，提高下游产品的得率。

技术实现思路

[0010]本专利技术针对色氨酸的代谢途径，采用新的遗传修饰方法改造微生物，并利用该微生物以更高效率和更高产量生产色氨酸。
[0011]具体而言，本专利技术通过提高微生物中磷酸解酮酶(phosphoketolase)的作用，新建磷酸乙酮醇酶途径，增加4
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磷酸
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赤藓糖代谢流，同时产生的乙酰磷酸进入三羧酸循环充分利用，从而使该微生物以更高效率和更高产量生产色氨酸。
[0012]根据本专利技术的一个实施方案，本专利技术涉及一种通过微生物发酵生产色氨酸的方法，该方法包括：
[0013]A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种能提高微生物中磷酸解酮酶(phosphoketolase，xfp)作用的遗传修饰；和
[0014]B)收集从培养步骤A)中产生的色氨酸。
[0015]在本专利技术中，提高微生物中磷酸解酮酶作用的遗传修饰选自a)微生物中磷酸解酮酶的酶活性增加；和/或b)微生物中磷酸解酮酶被过量表达；
[0016]本领域技术人员可以理解，为提高微生物中磷酸解酮酶的作用，可以通过筛选编码具有磷酸解酮酶的酶活性增加的基因突变体来实现。筛选xfp基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中xfp的作用，也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达xfp来实现。
[0017]在具体的实施方案中，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中磷酸解酮酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
[0018]在一个优选的实施方案中，微生物用至少一种包含编码磷酸解酮酶的核酸序列的重组核酸分子转化。
[0019]在一个方面，编码磷酸解酮酶的核酸序列含有至少一种增加磷酸解酮酶的酶活性的遗传修饰；进一步优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQ ID NO：1的下述位置
处的取代中的一种或多种：第178位半胱氨酸被丝氨酸取代、第343位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第482位半胱氨酸被酪氨酸取代；更优选，编码磷酸解酮酶的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。
[0020]在另一个方面，所述的磷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过微生物发酵生产色氨酸的方法，该方法包括：A)在发酵培养基中培养微生物，所述微生物包含至少一种能提高微生物中磷酸解酮酶(phosphoketolase)作用的遗传修饰；和B)收集从培养步骤A)中产生的色氨酸。2.如权利要求1所述的方法，其中，提高微生物中磷酸解酮酶作用的遗传修饰选自a)微生物中磷酸解酮酶的酶活性增加；和/或b)微生物中磷酸解酮酶被过量表达；优选，微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中磷酸解酮酶作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。3.如权利要求2所述的方法，其中，微生物用至少一种包含编码磷酸解酮酶的核酸序列的重组核酸分子转化；优选，编码磷酸解酮酶的核酸序列含有至少一种增加磷酸解酮酶的酶活性的遗传修饰；进一步优选，所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQ ID NO：1的下述位置处的取代中的一种或多种：第178位半胱氨酸被丝氨酸取代、第343位丝氨酸被苯丙氨酸取代和第482位半胱氨酸被酪氨酸取代；更优选，编码磷酸解酮酶的核酸序列为SEQ ID NO：3；优选，所述的磷酸解酮酶具有与SEQ ID NO:4的氨基酸序列至少约30％相同，优选至少约50％相同，进一步优选至少约70％相同，进一步优选至少约80％相同，更进一步优选至少约90％相同，最优选至少约95％相同的氨基酸序列，其中所述的磷酸解酮酶具有酶活性；进一步优选，所述的磷酸解酮酶具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；进一步优选，重组核酸分子中编码磷酸解酮酶的基因拷贝数增加；进一步优选，重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子；优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；进一步优选，具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。4.如权利要求2所述的方法，其中，微生物包括至少一种对编码磷酸解酮酶的基因的内源性天然启动子的遗传修饰；优选，编码磷酸解酮酶的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换；进一步优选，具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子；最优选，具有更高表达水平的启动子为trc启动子。5.如权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中，重组核酸分子被装入质粒中或重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。6.如权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中，所述重组核酸分子的表达是可诱导的；优选，所述重组核酸分子的表达可由乳糖诱导。7.如权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中，所述培养步骤A)在约20℃
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约45℃进行；优选，在约33℃
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约37℃进行；优选，所述培养步骤A)在约pH4.5
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约pH8.5进行；优选在约pH6.7
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约pH7.2进行；优选，所述培养步骤A)采用常规发酵培养基；进一步优选，发酵培养基中包含碳源；进一步优选，发酵培养基中包含氮源；进一步优选，发酵培养基中包含碳源和氮源；进一步优选，发酵培养基中包含碳源、氮源和无机盐；更进一步优选，各种碳源包括有机碳源和/或无机碳源；优选，碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或多种；优选，碳源的浓度维持在约
0.1％
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约5％；更进一步优选，各种氮源包括有机氮源和/或无机氮源；优选，氮源选自氨水、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵、硝酸钠、尿素、酵母浸膏、肉类浸膏、蛋白胨、鱼粉、豆粉、麦芽、玉米浆和棉籽粉中的一种或多种；优选，所述培养步骤A)采用补料发酵法；进一步优选，补糖液包含葡萄糖，优选，葡萄糖浓度为10％
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：邹季虹，
申请(专利权)人：南京寿柏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：