人类VKORC1和CYP2C9基因多态性检测用标准品产品及应用制造技术

本发明专利技术涉及基因检测领域，具体涉及了突变的人类VKORC1和CYP2C9基因多态性检测用标准品产品及应用，将含CYP2C9基因*2、*3三位及VKORC1基因VKORC1

【技术实现步骤摘要】
人类VKORC1和CYP2C9基因多态性检测用标准品产品及应用


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，尤其涉一种人类VKORC1和CYP2C9基因多态性检测用标准品产品及其制备方法。

技术介绍

[0002]华法林是目前临床上使用最早、最多、最广的口服抗凝药，已被应用于多种疾病的抗凝治疗，如静脉血栓栓塞性疾病(VTE)的一级和二级预防、心房颤动血栓栓塞的预防、瓣膜病、人工瓣膜置换术和心腔内血栓形成等，但其临床疗效和不良反应个体差异很大，剂量很难掌握，尤其是在使用华法林抗凝治疗初期，极易导致严重的出血并发症。据估计，服用华法林的患者中，每年有15.2％的人发生出血副作用，其中致命性的大出血占3.5％，不同个体间华法林稳定剂量的差异可达十余倍之多。大量研究表明，在我国华法林靶点基因VKORC1基因1639G＞A位点多态性和华法林代谢酶基因 CYP2C9基因*1、*2、*3位点多态性与其抗凝疗效密切相关，不同基因型患者所需华法林剂量差异明显。对人VKORC1基因VKORC1
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1639G＞A位点和CYP2C9基因CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3 位点的多态性进行定性检测，对华法林药物使用剂量及毒性反应进行预测。
[0003]基因多态性检测的主要方法有：限制性片段长度多态性(RFLP)检测、生物质谱检测、测序法检测、Taqman探针检测、基因芯片检测等方法。而这些方法在其特异性和灵敏度方面有很大差异。目前实时荧光定量PCR检测法相比普通PCR具有更高的灵敏度和特异性，被广泛应用。本项目标准品可贯穿基于荧光定量PCR基因检测的整个过程，建立从核酸提取到PCR扩增等流程的质量控制。对实验室内检测结果的失控状况及失控原因、了解不同医疗单位之间检验结果的差距具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种人类VKORC1和CYP2C9基因多态性检测用标准品产品及其应用，该方法获得的标准品准确度高、均匀度良好。
[0005]本专利技术首次建立了人类VKORC1和CYP2C9基因多态性检测用标准品产品及应用，达到了上述专利技术目的。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007](1)提取含有CYP2C9基因*2、*3三位及VKORC1基因VKORC1
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1639位点纯合野生、杂合突变型纯合突变型的细胞系基因组DNA作为模板，通过Sanger测序对多态性位点进行验证；
[0008](2)CYP2C9基因*2、*3三位及VKORC1基因VKORC1
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1639位点纯合野生、杂合突变型纯合突变型的细胞系基因组DNA定量测定；
[0009](3)量值测定通过测定标准物质核酸吸光度值，荧光PCR法以及Sanger测序法，采用实验内部多人员、多种方法进行定值。采用荧光定量PCR法进行基因分型验证，标准品均匀性验证。
[0010]其具体方法为：
[0011]采用Sanger测序方法以上述各基因型位点细胞系基因组DNA作为模板进行确认。测序结果见表 1。提取DNA的纯度见表2。
[0012]表1 Sanger测序法验证结果
[0013][0014]表2提取DNA的纯度
[0015]样本核酸浓度OD260/OD280GM1665412.031.89GM1227313.251.87GM1722212.031.73GM1728913.111.81GM1720412.641.84GM1724712.451.94
[0016]本专利技术的原理和有益效果在于：
[0017]提供了一种人类VKORC1和CYP2C9基因多态性检测标准品，细胞系质控品接近于临床样本，更好的模拟临检测，优于现有方法标准品，重组质粒由于不同实验室间存在序列选取差异，不能适用于市场上所有试剂盒，且无法准确对市场上所有个体化用药基因检测试剂盒进行鉴别。
[0018]定值精密度好。
附图说明
[0019]图1为Sanger测序法对CYP2C9*2位点CYP2C9*1/*1型的测序图。
[0020]图2为Sanger测序法对CYP2C9*2位点CYP2C9*1/*2型的测序图。
[0021]图3为Sanger测序法对CYP2C9*2位点CYP2C9*2/*2型的测序图。
[0022]图4为Sanger测序法对CYP2C9*3位点CYP2C9*1/*1型的测序图。
[0023]图5为Sanger测序法对CYP2C9*3位点CYP2C9*1/*3型的测序图。
[0024]图6为Sanger测序法对CYP2C9*3位点CYP2C9*3/*3型的测序图。
[0025]图7为Sanger测序法对VKORC1位点VKORC1
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1639GG型的测序图。
[0026]图8为Sanger测序法对VKORC1位点VKORC1
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1639GA型的测序图。
[0027]图9为Sanger测序法对VKORC1位点VKORC1
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1639AA型的测序图。
具体实施方式
[0028]下面通过具体实施方式进一步详细说明：
[0029]实施例1
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VKORC1和CYP2C9基因多态性标准品的制备
[0030]1.细胞系和培养基
[0031]细胞系GM16654、GM12273、GM17222、GM17289、GM17204、GM17247细胞系购自美国卡瑞尔细胞库(Coriell Institute)，所需的培养基及培养条件均参照说明书进行。培养基为1640+10％FBS， 5％CO2，37℃度培养。
[0032]2.DNA提取及Sanger测序验证
[0033]采用江苏百世诺医疗科技有限公司的基因组纯化试剂盒提取6株细胞系的基因组DNA，采用 Sanger测序对基因组DNA进行验证。
[0034]3.基因组纯度验证及定量
[0035]采用NanoDrop法微量紫外分光光度计测定基因组在260nm、280nm和230nm处的吸光值，用TE作为空白进行Blank，然后取2μL样品进行测定。并根据浓度计算基因组拷贝数对标准品进行定量。
[0036]4.荧光定量PCR法进行基因分型验证
[0037]以步骤2中6株细胞系的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系25μL，组分见下表3
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5。扩增程序见表6。
[0038]表3 CYP2C9*2反应液组分表
[0039][0040][0041]表4 CYP2C9*3反应液组分表
[0042]组份规格用量MasterBuffer2
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12.5μL上游引物10μM1.0μL下游引物10μM1.0μL内参上游引物10μM1.0μL内参下游引物10μM1.0μLFAM探针10μM0.3μLHEX探针10μM0.5μL酶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种VKORC1和CYP2C9基因多态性检测标准品的制各方法，包括以下步骤：(1)提取含有CYP2C9基因*2、*3三位及VKORC1基因VKORC1
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1639位点纯合野生、杂合突变型纯合突变型的细胞系基因组DNA作为模板，通过Sanger测序对多态性位点进行验证；(2)CYP2C9基因*2、*3三位及VKORC1基因VKORC1
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1639位点纯合野生、杂合突变型纯合突变型的细胞系基因组DNA定量...

【专利技术属性】
技术研发人员：张陆明，姜柳，顾建梅，
申请(专利权)人：江苏百世诺医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：