人类CYP2D6基因多态性检测用标准品产品及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因检测领域，具体涉及了突变的人类CYP2D6基因多态性检测用标准品产品及其应用，将含CYP2D6基因*10位点纯合野生、杂合突变型以及纯合突变型的细胞系DNA作为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物经过Sanger测序验证，可获得CYP2D6基因多态性的定性标准品。本标准品均匀性良好，可用于CYP2D6基因多态性检测荧光PCR方法的方法验证和质量控制。测荧光PCR方法的方法验证和质量控制。

【技术实现步骤摘要】
人类CYP2D6基因多态性检测用标准品产品及其应用


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，尤其涉一种人类CYP2D6基因多态性检测用标准品产品及其应用。

技术介绍

[0002]CYP2D6是第一个被确定由单基因控制的细胞色素P450酶，其主要在肝脏中表达，CYP2D6基因突变引起酶活性及数量的差异，导致对底物的代谢呈现出显著的个体差异，临床中使用CYP2D6底物药物主要为抗心律失常、β
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受体阻滞剂、抗忧郁及抗精神病等药物，这些经CYP2D6代谢的底物药物，因其基因的多态性，不同等位基因表达的酶蛋白活性差异很大，因此携带CYP2D6不同等位基因的患者使用其底物药物时药动学参数有显著的基因差异。如：去甲替林CYP2D6*10等位基因携带者动力学参数AUC高于、清除率低于、半衰期长于CYP2D6*1等位基因携带者；托莫西汀CYP2D6*10等位基因携带者的清除率低于CYP2D6快代谢50％；美托洛尔口服剂量大约80％通过CYP2D6代谢，CYP2D6*10可明显减慢美托洛尔的体内代谢。CYP2D6*10是中国人特有高频率携带的CYP2D6等位基因，其基因多态性对底物药物临床使用中安全性和有效性的影响已逐步被重视。
[0003]体外诊断试剂作为预防、诊断、治疗监测、预后观察、健康状态评价以及遗传性疾病预测的重要工具，其质量控制非常重要。调查显示，即使卫生部从2002年开始即对临床基因扩增检验实验室进行规范化管理，提出质量保证要求，但仍存在部分检验科各自为阵，缺乏统一的标准、室内质控及其分析形式化等问题。体外诊断试剂标准物质对于控制体外诊断试剂产品质量、保证临床检测结果准确度，起着十分关键的作用。由于存在很多制约因素，现阶段诊断试剂国家标准物质供应尚不能完全满足注册、生产和质量控制的需要。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种人类CYP2D6基因多态性检测用标准品产品及其应用，产品标准品准确度高、均匀度良好。
[0005]本专利技术首次建立了人类CYP2D6基因多态性检测用标准品产品及其应用，达到了上述专利技术目的。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007](1)提取含有CYP2D6基因*10位点纯合野生、杂合突变型以纯合突变型的细胞系基因组DNA作为模板，通过Sanger测序对多态性位点进行验证；
[0008](2)CYP2D6基因*10三位点纯合野生、杂合突变型以及纯合突变型的细胞系基因组DNA定量测定；
[0009](3)量值测定通过测定标准物质核酸吸光度值，荧光PCR法以及Sanger测序法，采用实验内部多人员、多种方法进行定值。采用荧光定量PCR法进行基因分型验证，标准品均匀性验证。
[0010]其具体方法为：
[0011]采用Sanger测序方法以上述各基因型位点细胞系基因组DNA作为模板进行确认。测序结果见表1。提取DNA的纯度见表2。
[0012]表1 Sanger测序法验证结果
[0013]细胞系位点基因型序列GM12273CYP2D6*10CYP2D6*1/*1见图1GM17240CYP2D6*10CYP2D6*1/*10见图2GM16654CYP2D6*10CYP2D6*10/*10见图3
[0014]表2提取DNA的纯度
[0015]样本核酸浓度OD260/OD280GM1227311.161.77GM1724010.871.75GM1665412.671.84
[0016]本专利技术的原理和有益效果在于：
[0017]提供了一种人类CYP2D6基因多态性检测标准品，细胞系质控品接近于临床样本，更好的模拟临检测，优于现有方法标准品，重组质粒由于不同实验室间存在序列选取差异，不能适用于市场上所有试剂盒，且无法准确对市场上所有个体化用药基因检测试剂盒进行鉴别。
[0018]定值精密度好。
附图说明
[0019]图1为Sanger测序法对CYP2D6*10位点CYP2D6*1/*1型的测序图。
[0020]图2为Sanger测序法对CYP2D6*10位点CYP2D6*1/*10型的测序图。
[0021]图3为Sanger测序法对CYP2D6*10位点CYP2D6*10/*10型的测序图。
具体实施方式
[0022]下面通过具体实施方式进一步详细说明：
[0023]实施例1
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CYP2D6基因多态性标准品的制备
[0024]1.细胞系和培养基
[0025]细胞系GM12273、GM17240、GM16654。细胞系购自美国卡瑞尔细胞库(Coriell Institute)，所需的培养基及培养条件均参照说明书进行。培养基为1640+10％FBS，5％CO2，37℃度培养。
[0026]2.DNA提取及Sanger测序验证
[0027]采用江苏百世诺医疗科技有限公司的基因组纯化试剂盒提取3株细胞系的基因组DNA，采用Sanger测序对基因组DNA进行验证。
[0028]3.基因组纯度验证及定量
[0029]采用NanoDrop法微量紫外分光光度计测定基因组在260nm、280nm和230nm处的吸光值，用TE作为空白进行Blank，然后取2μL样品进行测定。并根据浓度计算基因组拷贝数对标准品进行定量。
[0030]4.荧光定量PCR法进行基因分型验证
[0031]以步骤2中3株细胞系的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系25μL，组分见下表3。扩增程序见表4。
[0032]表3 CYP2D6*10反应液组分表
[0033]组份规格用量MasterBuffer2
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12.5μL上游引物10μM1.0μL下游引物10μM1.0μL内参上游引物10μM1.0μL内参下游引物10μM1.0μLFAM探针10μM0.3μLHEX探针10μM0.5μL酶混合液
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0.5μLDEPC水 补齐至20μL
[0034]表4扩增程序
[0035][0036]5.对均匀性检验中的试验结果进行F检验
[0037]对样品随机选取15管，每管取样三次，因此共45份样品。取样量为200μL/次，通过人类全血基因组DNA提取试剂盒(江苏百世诺医疗科技有限公司)提取DNA后，利用测定核酸吸光度值方法进行分析，检测样品在瓶内以及瓶间的均匀性情况。
[0038]单元内方差的计算公式如下：
[0039][0040]单元间方差的计算公式如下：
[0041][0042]计算统计量F计算公式如下：
[0043][0044]二、结果
[0045]1.DNA提取及Sanger测序验证结果
[0046]CYP2D6*10位点纯合野生、杂合突变型以及纯合突变型Sanger测序鉴定结果见图1
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3。检测结果为对应基因型。
[0047]2.基因组纯度本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CYP2D6基因多态性检测标准品及其应用，包括以下步骤：(1)提取含有CYP2D6基因*10点纯合野生、杂合突变型以及纯合突变型的细胞系基因组DNA作为模板，通过Sanger测序对多态性位点进行验证；(2)CYP2D6基因*10位点纯合野生、杂合突变型以及纯合突变型的细胞系基因组DNA定量测定；(3)采用荧光定量PCR法进行基因分型验证，标准品...

【专利技术属性】
技术研发人员：张陆明，姜柳，宗荣芳，
申请(专利权)人：江苏百世诺医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：